基于MHC基因選育的棘胸蛙后代遺傳穩(wěn)定性及抗病性分析.pdf

1、主要組織相容性復(fù)合體(MHC)是廣泛存在于脊椎動(dòng)物體內(nèi)與免疫功能密切相關(guān)的高度多態(tài)基因群。研究表明，MHCⅡ類抗原與許多動(dòng)物疾病的抗病性、感病性密切相關(guān)。MHC作為一種內(nèi)在因子，其變異模式被認(rèn)為在兩棲動(dòng)物數(shù)量的下降中起了關(guān)鍵作用。棘胸蛙(Quasipaa spinosa)，又被稱為石雞，是我國(guó)棘蛙屬中分布范圍最廣的物種之一，目前主要分布在長(zhǎng)江以南地區(qū)。人類活動(dòng)不僅破壞了野生棘胸蛙的生活環(huán)境，而且使得野生棘胸蛙資源被過(guò)渡開發(fā)利用，加之全球

2、變暖引起的疾病傳播，導(dǎo)致棘胸蛙種群數(shù)量不斷下降。為保護(hù)棘胸蛙資源，研究與其免疫力有關(guān)的MHC基因具有重要意義。
　　為研究MHC等位基因與棘胸蛙對(duì)疾病抵抗力的相關(guān)性，隨機(jī)選取100只健康棘胸蛙腹腔注射嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydropfila）進(jìn)行人工感染，然后利用特異性引物，擴(kuò)增47只存活個(gè)體（抗病棘胸蛙）和53只死亡個(gè)體（易感病棘胸蛙）的MHCⅡB基因，得到了長(zhǎng)度為186bp的外顯子2序列。挑取出402個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)

3、行測(cè)序，經(jīng)序列比對(duì)共得到31條不同的核苷酸序列。最終選取6條等位基因用于研究MHCⅡB類基因多態(tài)性與棘胸蛙抗病性和易感性之間的關(guān)聯(lián)。選取的6條等位基因雖然同時(shí)存在于死亡個(gè)體和存活病個(gè)體中，但它們出現(xiàn)的頻率不同?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果顯示，等位基因qasp-DAB*h和qasp-DAB*1在存活個(gè)體中出現(xiàn)的概率明顯高于在死亡個(gè)體中出現(xiàn)的概率，它們可能與棘胸蛙對(duì)嗜水氣單胞菌感染的抵抗性相關(guān);而等位基因qasp-DAB* e則更多的出現(xiàn)在感病個(gè)體中，說(shuō)

4、明其可能與棘胸蛙對(duì)嗜水氣單胞菌的敏感性相關(guān)。
　　抗病個(gè)體暫養(yǎng)在養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)自然繁殖子代。從子一代中隨機(jī)挑選150只個(gè)體用于研究抗病子一代的抗病性及遺傳穩(wěn)定性。用本實(shí)驗(yàn)室分離并鑒定的嗜水氣單胞菌、不動(dòng)桿菌（Acinetobacter Citrobacter）及檸檬酸桿菌（Werkman and Gillen）去感染子一代個(gè)體，感染后的存活率分別為90％、84％和80％，其明顯高于普通群體的存活率，并且子一代對(duì)3種病菌的抵抗力不存在顯著

5、性差異。通過(guò)測(cè)序的方法獲得子一代個(gè)體的MHCⅡB外顯子2，得到的多態(tài)性序列在親本中全都存在，并且qasp-DAB*h和qasp-DAB*1在子一代中出現(xiàn)的頻率分別為0.56和0.47，明顯高于其在普通個(gè)體中出現(xiàn)的頻率。說(shuō)明這兩個(gè)抗病相關(guān)基因在子代間是可以穩(wěn)定遺傳的。因此，qasp-DAB*h和qasp-DAB*1可作為分子標(biāo)記應(yīng)用于棘胸蛙優(yōu)良品種的選育中。測(cè)定了抗病親本子一代和普通個(gè)體的白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)、吞噬細(xì)胞的吞噬能力和吞噬指數(shù)等