抗病轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)育明恢63后代抗性純合系的篩選及其遺傳穩(wěn)定性研究.pdf

1、稻瘟病是水稻稻作區(qū)一種嚴重的真菌性病害。培育抗病品種是解決這一病害最有效的途徑，通過生物技術(shù)手段與常規(guī)選育相結(jié)合創(chuàng)制抗病新種質(zhì)預(yù)示了良好的應(yīng)用前景。本研究以攜帶外源溶菌酶基因的ZH9(R)(高抗稻瘟病)為抗源供體，以優(yōu)良的超級雜交稻恢復(fù)系明恢63(MH63)為受體，通過對MH63回交轉(zhuǎn)育轉(zhuǎn)移溶菌酶基因，獲得抗性改良的新恢復(fù)系。作者在獲得回交2-4代材料的基礎(chǔ)上，通過抗生素輔助篩選體系進一步鑒定出轉(zhuǎn)基因純合系；對轉(zhuǎn)育后代目的基因的追蹤及抗

2、病性鑒定、抗性純合系的人工接種鑒定，分析外源基因的遺傳規(guī)律、轉(zhuǎn)育材料的抗性表現(xiàn)及稻瘟病抗性的遺傳穩(wěn)定性；對轉(zhuǎn)育后代主要農(nóng)藝性狀的考察，分析轉(zhuǎn)育后代農(nóng)藝性狀的遺傳穩(wěn)定性，并通過定向選擇篩選出綜合性狀優(yōu)良的抗病株系。 1.明恢63轉(zhuǎn)育后代中抗性純合系的篩選 在本課題組先前建立的轉(zhuǎn)基因水稻快速檢測技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過G418對抗生素標(biāo)記基因的輔助篩選(種子篩選和葉片篩選)，從轉(zhuǎn)育后代中快速鑒定出外源溶菌酶基因純合的轉(zhuǎn)育株系。

3、 研究發(fā)現(xiàn)，在一定濃度的G418脅迫條件下，轉(zhuǎn)育株系各器官、組織對抗生素具有不同的抗感反應(yīng)。在種子篩選中，根據(jù)G418對水稻種子發(fā)芽特性(發(fā)芽率、生根率、根伸長受阻等抑制效應(yīng))篩選出高抗抗生素類株系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TD-3、TD-10、TD-18三個株系發(fā)芽率、生根率、長根類種子比率都達90％左右，死亡率在10％以下，說明群體受抗生素毒害小，推測此株系為npt-Ⅱ基因純合系，繼續(xù)選其葉片做抗生素篩選試驗及分子檢測。 隨后對這些材

4、料做抗生素脅迫下的離體葉片鑒定，經(jīng)χ2檢測陽性株與陰性株分離比為1∶0；PCR檢測結(jié)果進一步證實同一株系內(nèi)各單株不發(fā)生分離，因此這三個株系最終被確認為npt-Ⅱ基因、溶菌酶基因純合系。 通過對回交轉(zhuǎn)育后代株系的離體葉片篩選，共獲得19個抗性純系，其中BC4F3代3個，BC3F4代10個、BC2F5代6個。 2.明恢63轉(zhuǎn)育后代抗稻瘟病遺傳穩(wěn)定性研究 通過各轉(zhuǎn)育世代部分株系的外源基因檢測，轉(zhuǎn)育后代稻瘟病抗性的大田鑒

5、定及抗性純合系的人工接種鑒定，分析溶菌酶基因的遺傳規(guī)律、轉(zhuǎn)育后代的抗性表現(xiàn)及抗性遺傳穩(wěn)定性，并評價溶菌酶基因的抗性效果。得出如下結(jié)論： 1)對由同一系譜來的分屬于BC4F1、BC4F2、BC4F3代3個株系做葉片抗生素檢測，經(jīng)遺傳分析，得出外源基因為單基因顯性遺傳，符合孟德爾遺傳規(guī)律。對純合系TD-10與不育系測交后代進行溶菌酶基因分子檢測，結(jié)果都擴增出了特異性條帶，由此說明外源基因能在轉(zhuǎn)育后代中穩(wěn)定傳遞，且能通過雜交穩(wěn)定遺傳給

6、下一代。 2)從兩年的病圃抗性鑒定情況看，轉(zhuǎn)育后代對稻瘟病抗性明顯好于MH63。2004年各世代葉瘟病情指數(shù)比MH63降低11％，穗頸瘟病情指數(shù)比MH63降低14％；2005年葉瘟病情指數(shù)比MH63降低2％，穗頸瘟降低13％。在世代間的比較中2004年以回交高世代抗性好于低世代，而2005年這種差異不顯著：2004年葉瘟抗性BC4F1病情指數(shù)比BC3F2、BC2F3分別下降6.62％、11.63％，穗頸瘟抗性BC4F1病情指數(shù)比

7、BC3F2、BC2F3分別下降4.18％和2.39％；2005年各世代葉瘟抗性差異不顯著，都為25％左右，穗頸瘟BC4F3代病情指數(shù)比BC2F5僅下降1.34％。 3)分析了各世代抗性株系穗頸瘟抗性指標(biāo)和變異系數(shù)，各世代株系間病情指數(shù)波動不大，損失指數(shù)、病情指數(shù)變異系數(shù)普遍較低，分別在0.04和0.07以下，說明抗性純合系抗性較穩(wěn)定。 4)葉瘟和穗頸瘟病情指數(shù)相關(guān)系數(shù)都超過了0.5，說明二者有一定的正相關(guān)性，BC3F4代

8、相關(guān)性較大，接近0.7，BC4F3次之，為0.5772，BC2F5為0.5536。 5)人工接種76個菌株發(fā)現(xiàn)，BC4F3代純合株系TD-10對8個菌株感病，其抗性頻率為89.47％，TD-3、TD-18分別對7個、6個菌株感病，其抗性頻率都超過了90％，屬高抗(HR)水平；而輪回親本明恢63對其中21個菌株感病，其抗性頻率為72.37％，屬中抗(MR)水平。轉(zhuǎn)育材料較明恢63抗譜增加18.42％，與溶菌酶基因?qū)λ腩i瘟抗性貢獻率

9、估計值(15％-21％)較為一致，這充分說明了溶菌酶基因?qū)Φ疚敛【哂休^強的廣譜抗性，通過轉(zhuǎn)育能顯著提高其親本抗性。 3.明恢63轉(zhuǎn)育后代農(nóng)藝性狀遺傳穩(wěn)定性研究 通過農(nóng)藝性狀考察，分析各轉(zhuǎn)育后代回復(fù)效果，并分析各回交自交后代農(nóng)藝性狀的遺傳穩(wěn)定性，通過定向選擇，選育出具有優(yōu)良變異特性的新種質(zhì)。 1)通過株高、穗長、結(jié)實率、千粒重、單株產(chǎn)量5個主要農(nóng)藝性狀考察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)育后代隨著回交次數(shù)增加，與明恢63的差異逐漸縮小，

10、株高在回交2次后與明恢63僅相差0.6cm、穗長回交2次后超過親本0.55cm，結(jié)實率在回交3次后超過親本1.97％，千粒重、單株產(chǎn)量在回交3次后分別超過親本0.14g、1.72g。這說明通過適當(dāng)?shù)幕亟煌耆梢砸胗H本的優(yōu)良特性。 2)同一回交代隨著自交代的增加，各農(nóng)藝性狀變異系數(shù)降低，在自交3代后，變異系數(shù)穩(wěn)定且趨向于0，說明這些農(nóng)藝性狀隨著自交世代增加會越趨穩(wěn)定。 3)在選擇時入選親本特性的基礎(chǔ)上還兼顧其他優(yōu)良性狀，