抗凝血酶Ⅲ轉(zhuǎn)基因山羊遺傳穩(wěn)定性的檢測(cè).pdf

1、本試驗(yàn)以ATⅢ轉(zhuǎn)基因原代山羊及雜交產(chǎn)生的后代組成的轉(zhuǎn)基因山羊核心群為研究對(duì)象，以ATⅢ基因(AntithrombinⅢ，ATⅢ)作為檢測(cè)的目的基因，利用PCR技術(shù)、定量PCR技術(shù)、ELISA技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因山羊核心群ATⅢ基因的轉(zhuǎn)基因構(gòu)件的完整性、山羊外源基因整合位點(diǎn)的平均拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)入的外源基因RNA的表達(dá)量及山羊乳腺中蛋白的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，探討了影響基因表達(dá)的因素及山羊群體轉(zhuǎn)基因世代遺傳的穩(wěn)定性。結(jié)果如下:
　　 1、提取轉(zhuǎn)基因

2、山羊耳部組織DNA，依據(jù)ATⅢ基因在嶗山奶山羊β-酪蛋白基因上構(gòu)造的轉(zhuǎn)基因構(gòu)件設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，3個(gè)家系的20只山羊都擴(kuò)增出了ATⅢ基因。轉(zhuǎn)基因構(gòu)件擴(kuò)增結(jié)果顯示:在A系轉(zhuǎn)基因山羊的4個(gè)不同世代的個(gè)體中，都擴(kuò)出了1.4kb長(zhǎng)的預(yù)期片段，經(jīng)測(cè)序分析，在同一家系四個(gè)世代轉(zhuǎn)基因山羊的遺傳中，轉(zhuǎn)基因表達(dá)框完整，含有插入的酶切位點(diǎn)(Xho1)、Enterokinase蛋白質(zhì)酶切DNA序列目的基因序列，目的基因序列與GENEBANK公布的ATⅢ

3、基因序列保持一致，且四個(gè)世代間沒有出現(xiàn)構(gòu)件的丟失，通過有性繁殖遺傳穩(wěn)定。
　　 2、設(shè)計(jì)外源基因ATⅢ及山羊管家基因GAPDH的引物，對(duì)20只山羊樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢驗(yàn)，以ATⅢ、GAPDH基因陽(yáng)性克隆子倍比稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算外源基因的平均拷貝數(shù)。結(jié)果:ATⅢ和GAPDH基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為L(zhǎng)ogN1=-0.411CT+11.902;LogN2=-0.343CT+10.58

4、8。通過目的基因ATⅢ和山羊內(nèi)源參照基因GAPDH起始模板數(shù)的比較計(jì)算獲得:陰性對(duì)照的平均拷貝數(shù)為0.052，確定陰性對(duì)照目的基因拷貝數(shù)為0，山羊A-23、A-24、A-39、A-46、A-43，可判定為非轉(zhuǎn)基因個(gè)體，其余計(jì)算得到的山羊個(gè)體間外源基因的拷貝數(shù)相差很大，有6只山羊拷貝數(shù)為10以下，6只山羊拷貝數(shù)為10-15，拷貝數(shù)20以上的有2只。
　　 3、提取轉(zhuǎn)基因山羊乳腺組織mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin作為內(nèi)

5、參基因進(jìn)行熒光定量PCR，以半定量的方法檢測(cè)選取的5只轉(zhuǎn)基因山羊個(gè)體間目的基因ATⅢ的相對(duì)表達(dá)量。對(duì)3個(gè)家系中10只雌性山羊的奶樣進(jìn)行收集，送由醫(yī)院通過ELISA法對(duì)ATⅢ基因在乳腺組織中的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明:外源目的基因ATⅢ在乳腺組織中蛋白表達(dá)量同ATⅢ基因mRNA的表達(dá)量的變化相一致，乳腺組織中蛋白的表達(dá)量在同一家系中的不同個(gè)體間有較大差異，即使同系同代山羊個(gè)體間表達(dá)量也不盡相同，后代山羊外源蛋白的表達(dá)量與上一代相比有升高也