肝素金納米粒子的制備及其對抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)的識別.pdf

1、近年來，金納米粒子由于其特殊的化學和物理性質(zhì)，在催化、光學、電學、表面增強拉曼散射、生物傳感器及納米技術(shù)等新興領(lǐng)域表現(xiàn)出了廣泛的應(yīng)用前景。大分子如蛋白質(zhì)、DNA等修飾的金納米粒子由于其光學特性越來越受到關(guān)注，并被廣泛應(yīng)用于免疫學、診斷學等領(lǐng)域。糖類化合物也是一種生物大分子，可以與其他物質(zhì)形成糖脂和糖蛋白等，因此具有細胞識別、免疫活性等多種生理活性功能。但是糖類修飾的金納米粒子的研究尚在發(fā)展階段，其制備及檢測條件還不成熟，需要進行深入探討

2、。 肝素是存在于哺乳動物上皮細胞表面帶負電的高度硫酸化多糖，能與多種蛋白質(zhì)作用，因此有重要的生物學活性。本文主要研究肝素金納米粒子的制備條件及其對抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）的檢測。包括：（1）巰基化肝素衍生物的制備；（2）巰基化肝素衍生物修飾的金納米粒子的制備；（3）肝素金納米粒子對抗凝血酶Ⅲ的檢測。 通過亞硝酸降解的方法，將肝素鈉制備成末端帶有醛基的低分子量肝素。對巰基苯胺和末端帶醛基的肝素會形成不穩(wěn)定的希夫堿結(jié)構(gòu)（Schi

3、ff Base），在氰基硼氫化鈉催化下，通過還原胺化的方法，制備出末端有巰基的肝素衍生物。控制反應(yīng)時間等反應(yīng)條件，考察其對巰基化肝素含量的影響。用Ellman試劑對巰基肝素衍生物的取代度進行測定，確定產(chǎn)物中巰基的含量。發(fā)現(xiàn)在溶劑為二甲亞砜與冰醋酸的體積比為8:1時，反應(yīng)6h，11.13％的肝素被衍生化。用紅外光譜儀（ FTIR）和核磁共振光譜儀對末端帶有醛基的肝素和巰基化肝素衍生物進行了結(jié)構(gòu)分析，驗證了肝素衍生物中巰基的存在。

4、通過檸檬酸鈉還原法制備得到金納米粒子，探討還原劑加入量以及pH值對制備納米粒子的影響。發(fā)現(xiàn)制備金納米粒子時，當檸檬酸鈉與氯金酸的摩爾比為6:1時，制備出粒徑均一且分散性好的金納米粒子，且在pH值中性至堿性范圍內(nèi)能保持穩(wěn)定。透射電鏡的結(jié)果表明制備得到的金納米粒子粒徑均一，平均粒徑在10 nm。紫外分光光度計測定其紫外最大吸收波長在523 nm處?？疾焱度氩煌瑤€基化肝素衍生物的量對修飾后金納米粒子的影響，確定合適的肝素衍生物修飾量為0.12

5、5～25 mg/ml，且在0.5 h內(nèi)，結(jié)合率達到最高，結(jié)合率在27％～38％。修飾后金納米粒子的粒徑發(fā)生改變，平均粒徑為22 nm，其紫外最大吸收波長在531 nm處，比修飾前紅移8 nm，說明金納米粒子的粒徑大小對紫外吸收有影響。并且肝素以Au—S共價鍵合的方式定向固定在金納米粒子表面，穩(wěn)定性好，不受外界條件影響。 最后探討了巰基化肝素修飾的金納米粒子用于檢測抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）的檢測靈敏度及最小檢測限。在紫外分光光度計的檢

6、測下，當溶液中的ATⅢ的含量最低為17.2 pmol時，紫外最大吸收波長為534 nm，比不含有ATⅢ的溶液紫外最大吸收533 nm，紅移1 nm。隨著加入AT—Ⅲ量的增多，波長紅移更為明顯。同時用金納米粒子標記的抗體A4C11和A14A11來檢測甲胎蛋白。當兩種抗體標記時間為6小時，結(jié)合率達到最高，分別為70.39％和92.29％。當甲胎蛋白的濃度最低為1.21 ng/ml時，金納米粒子的紫外最大吸收波長為533 nm，而不含有甲胎蛋