西甜瓜轉(zhuǎn)基因抗病毒研究.pdf

1、西甜瓜是我國(guó)重要的葫蘆科作物，其栽培面積和消費(fèi)總量位居世界蔬菜水果前列。病毒病是葫蘆科作物生產(chǎn)中存在的重大問(wèn)題，嚴(yán)重影響著西瓜和甜瓜的產(chǎn)量與品質(zhì)。病毒病大面積爆發(fā)時(shí)，導(dǎo)致產(chǎn)量降低，甚至絕產(chǎn)。通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段，將病毒的相關(guān)基因通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入西瓜和甜瓜，探討病毒與葫蘆科寄主作物之間的關(guān)系，創(chuàng)制新的抗病毒葫蘆科作物新種質(zhì)，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本研究的主要結(jié)果如下:
　　1.優(yōu)化了西瓜的組織培養(yǎng)體系。西瓜離體

2、繼代培養(yǎng)過(guò)程中，西瓜組培苗容易黃化，隨著繼代時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸衰老死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e鹽對(duì)黃化的影響最大，將Fe-EDTA濃度加倍，組培苗生長(zhǎng)健壯，可以持續(xù)繼代。西瓜繼代苗根數(shù)少，清洗瓊脂時(shí)，容易斷根。將伸長(zhǎng)至2-3cm的西瓜小植株，切下作為接穗，嫁接到兩片子葉完全展開的砧木上，不僅能提高成活率，而且西瓜植株生長(zhǎng)健壯，果實(shí)提早成熟一個(gè)月。解決了西瓜再生苗黃化和移栽成活率低的問(wèn)題，為西瓜轉(zhuǎn)基因技術(shù)奠定了好的基礎(chǔ)。
　　2.建立了西瓜

3、的遺傳轉(zhuǎn)化體系。西瓜種子在1/2 MS培養(yǎng)基上萌發(fā)4-5d，子葉顏色從黃色剛剛轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色作為外植體，切除生長(zhǎng)點(diǎn)的子葉基端接種在培養(yǎng)基MS+BA1.0mg/L預(yù)培養(yǎng)5d，農(nóng)桿菌侵染20 min，共培養(yǎng)5d。轉(zhuǎn)基因材料通過(guò)PCR和Southern雜交檢測(cè)，初步驗(yàn)證基因整合到西瓜基因組。
　　3.人工小RNA能夠結(jié)合病毒RNA并降解其基因組，對(duì)病毒產(chǎn)生抗性。本研究利用人工小RNA技術(shù)設(shè)計(jì)的人工小RNA，可以識(shí)別黃瓜花葉病毒CMV2a/2

4、b基因部分編碼區(qū)對(duì)CMV病毒進(jìn)行基因表達(dá)抑制。轉(zhuǎn)化西瓜材料，接種后，轉(zhuǎn)基因株系通過(guò)ELISA檢測(cè)，初步驗(yàn)證表達(dá)人工小RNA的轉(zhuǎn)基因西瓜材料對(duì)CMV病毒具有抗性。
　　4.建立了甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系。甜瓜子葉顏色由黃色轉(zhuǎn)為綠色時(shí)作為外植體，距下胚軸1-2mm處，切下子葉基端在培養(yǎng)基MS+BA1.2mg/L中預(yù)培養(yǎng)5d，與農(nóng)桿菌侵染20min，共培養(yǎng)3d。通過(guò)PCR和Southern雜交檢測(cè)，以及GUS染色，進(jìn)一步證明甜瓜轉(zhuǎn)基因技術(shù)穩(wěn)定。

5、
　　5.具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植株，在植物體內(nèi)表達(dá)能夠誘導(dǎo)基因沉默，協(xié)同發(fā)揮抗病機(jī)制。本研究構(gòu)建ZYMV、WMV和CMV的3個(gè)外殼蛋白基因嵌合片段(CWZ)反向重復(fù)植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化常規(guī)甜瓜品種，將三種病毒的基因片段整合到甜瓜基因組，為探討轉(zhuǎn)基因葫蘆科作物通過(guò)RNA沉默實(shí)現(xiàn)抗病毒提供了新的方法。
　　本研究為葫蘆科作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供了一些新的手段和方法，獲得了轉(zhuǎn)基因抗病毒的西瓜和甜瓜材料，具有一定的