西甜瓜轉基因抗病毒研究.pdf

1、西甜瓜是我國重要的葫蘆科作物，其栽培面積和消費總量位居世界蔬菜水果前列。病毒病是葫蘆科作物生產中存在的重大問題，嚴重影響著西瓜和甜瓜的產量與品質。病毒病大面積爆發(fā)時，導致產量降低，甚至絕產。通過轉基因手段，將病毒的相關基因通過農桿菌介導的遺傳轉化方法導入西瓜和甜瓜，探討病毒與葫蘆科寄主作物之間的關系，創(chuàng)制新的抗病毒葫蘆科作物新種質，具有重要的理論意義和實際應用價值。本研究的主要結果如下:
　　1.優(yōu)化了西瓜的組織培養(yǎng)體系。西瓜離體

2、繼代培養(yǎng)過程中，西瓜組培苗容易黃化，隨著繼代時間的延長，逐漸衰老死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e鹽對黃化的影響最大，將Fe-EDTA濃度加倍，組培苗生長健壯，可以持續(xù)繼代。西瓜繼代苗根數(shù)少，清洗瓊脂時，容易斷根。將伸長至2-3cm的西瓜小植株，切下作為接穗，嫁接到兩片子葉完全展開的砧木上，不僅能提高成活率，而且西瓜植株生長健壯，果實提早成熟一個月。解決了西瓜再生苗黃化和移栽成活率低的問題，為西瓜轉基因技術奠定了好的基礎。
　　2.建立了西瓜

3、的遺傳轉化體系。西瓜種子在1/2 MS培養(yǎng)基上萌發(fā)4-5d，子葉顏色從黃色剛剛轉變?yōu)榫G色作為外植體，切除生長點的子葉基端接種在培養(yǎng)基MS+BA1.0mg/L預培養(yǎng)5d，農桿菌侵染20 min，共培養(yǎng)5d。轉基因材料通過PCR和Southern雜交檢測，初步驗證基因整合到西瓜基因組。
　　3.人工小RNA能夠結合病毒RNA并降解其基因組，對病毒產生抗性。本研究利用人工小RNA技術設計的人工小RNA，可以識別黃瓜花葉病毒CMV2a/2

4、b基因部分編碼區(qū)對CMV病毒進行基因表達抑制。轉化西瓜材料，接種后，轉基因株系通過ELISA檢測，初步驗證表達人工小RNA的轉基因西瓜材料對CMV病毒具有抗性。
　　4.建立了甜瓜遺傳轉化體系。甜瓜子葉顏色由黃色轉為綠色時作為外植體，距下胚軸1-2mm處，切下子葉基端在培養(yǎng)基MS+BA1.2mg/L中預培養(yǎng)5d，與農桿菌侵染20min，共培養(yǎng)3d。通過PCR和Southern雜交檢測，以及GUS染色，進一步證明甜瓜轉基因技術穩(wěn)定。

5、
　　5.具有發(fā)卡結構的植物表達載體導入植株，在植物體內表達能夠誘導基因沉默，協(xié)同發(fā)揮抗病機制。本研究構建ZYMV、WMV和CMV的3個外殼蛋白基因嵌合片段(CWZ)反向重復植物表達載體，利用農桿菌介導法轉化常規(guī)甜瓜品種，將三種病毒的基因片段整合到甜瓜基因組，為探討轉基因葫蘆科作物通過RNA沉默實現(xiàn)抗病毒提供了新的方法。
　　本研究為葫蘆科作物轉基因技術提供了一些新的手段和方法，獲得了轉基因抗病毒的西瓜和甜瓜材料，具有一定的