幾個(gè)種類蘭花的轉(zhuǎn)基因抗病毒新品種培育研究.pdf

1、蘭花是蘭科（Ocrhidaceae））植物的總稱，是開(kāi)花植物中最大的一個(gè)科，屬于單子葉植物，是目前花卉中價(jià)值最高的種類之一。由于蘭花比較難以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，并且蘭科植物的花有許多獨(dú)有的特征，因此進(jìn)行蘭花轉(zhuǎn)基因的研究不僅可以為蘭花分子生物學(xué)研究打下良好的基礎(chǔ)而且還有很大的商業(yè)利用價(jià)值，在基礎(chǔ)理論研究和實(shí)際應(yīng)用方面都具有重要意義。
　　 本文以9個(gè)種類具有重要價(jià)值的蘭花（大花蕙蘭、卡特蘭、中國(guó)蘭屬附生種類等）為材料，應(yīng)用農(nóng)桿菌和基因槍

2、兩種轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因研究。建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CyMV）和齒蘭環(huán)斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV）是危害蘭花的兩種主要病毒。為了使蘭花具有抗病毒病的優(yōu)良性狀，將分別攜帶CyMV和ORSV兩種病毒外殼蛋白基因的表達(dá)載體PBI121、PBI221分別轉(zhuǎn)化大花蕙蘭、卡特蘭、中國(guó)蘭屬附生種類等9個(gè)種類的蘭花。
　　 1.研究確定了各類蘭花的最佳抗生素篩

3、選濃度。表達(dá)載體中有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（NptⅡ）作為篩選標(biāo)記基因，選擇具有抗卡那霉素的植株。大花蕙蘭的抗生素最佳篩選濃度為25 mg/L的卡那霉素.卡特蘭的抗生素最佳篩選濃度為25 mg/L的卡那霉素，中國(guó)蘭屬附生種類中的根狀莖抗生素最佳篩選濃度為50 mg/L的卡那霉素，類原球莖最佳篩選濃度為10 mg/L的卡那霉素。
　　 2.農(nóng)桿菌侵染方法和合適的共培養(yǎng)時(shí)間，農(nóng)桿菌浸泡在菌液中20 min較為適宜，共培養(yǎng)時(shí)間5天較為適

4、宜。
　　 3.基因槍轉(zhuǎn)化方法中所用微粒載體為直徑1.0μm鎢粉，轟擊壓力定為1100 psi，轟擊距離為9 cm、真空度為25 mgHg，基因槍轟擊后，恢復(fù)培養(yǎng)一周后，轉(zhuǎn)入含有卡那霉素的抗性篩選培養(yǎng)基，能有效的篩選出抗性苗。
　　 4.研究獲得的抗性植株進(jìn)行了PCR檢測(cè)，設(shè)計(jì)了合適的PCR引物，并確定了適宜的PCR反應(yīng)條件和體系，最終得到PCR水平的98個(gè)陽(yáng)性株系。分析比較了農(nóng)桿菌和基因槍兩種轉(zhuǎn)化方法，在抗性苗的出苗率