甘藍(lán)型油菜BnF3’H基因的反義轉(zhuǎn)化.pdf

1、甘藍(lán)型油菜(Brassica napus L.)是世界四大油料作物之一。甘藍(lán)型黃籽油菜與黑籽油菜相比較，具有種皮色素少、種皮薄、纖維素含量低以及蛋白質(zhì)和含油量高的優(yōu)點(diǎn)，因而培育遺傳穩(wěn)定、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的甘藍(lán)型黃籽油菜已成為油菜育種的一個(gè)重要目標(biāo)之一。 研究表明，植物種皮色素的主要成分是原花青素(proanthocyanidins，PAs)的聚合物，它是由苯丙烷-類黃酮-花青素-原花青素復(fù)合途徑而合成的。類黃酮3’-羥化酶(flav

2、onoid3'-hydroxylase，F(xiàn)3'H)是類黃酮途徑中的關(guān)鍵酶之一，對(duì)于花青素和原花青素的生物合成起重要作用。擬南芥(Arabidopsis thaliana)中F3'H基因的功能失活性突變均導(dǎo)致種皮顏色由野生型的深褐色變成黃色或灰褐色，即透明種皮(TRANSPARENT TESTA，TT)，突變體命名為tt7。 本課題組從前的研究已經(jīng)克隆了甘藍(lán)型油菜的F3'H(BnF3'H)基因的全長(zhǎng)序列，完成了原核表達(dá)、RT-PC

3、R等功能鑒定，并構(gòu)建了反義植物表達(dá)載體，但尚未完成轉(zhuǎn)化油菜本身的功能鑒定和轉(zhuǎn)基因分子育種研究。為此，本研究將該反義植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化了甘藍(lán)型油菜黑籽優(yōu)良新品種中雙10號(hào)，并取得了以下結(jié)果： 1.以中雙10號(hào)下胚軸為受體，獲得了優(yōu)化的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系。本研究在參考油菜轉(zhuǎn)化的國(guó)際先進(jìn)技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合本研究的實(shí)際情況，對(duì)影響油菜轉(zhuǎn)化的一些重要技術(shù)因素進(jìn)行了單因素尋優(yōu)研究，綜合各試驗(yàn)結(jié)果后得到了一套優(yōu)化的中雙10號(hào)轉(zhuǎn)化技術(shù)體系。取8d齡

4、幼苗的中雙10號(hào)無(wú)菌苗下胚軸段，接入MSp培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)3d，然后在OD600=0.2的農(nóng)桿菌工程菌株菌液菌液中浸染5 min，轉(zhuǎn)入MSc固體培養(yǎng)基上中，于暗處、25℃共培養(yǎng)36h。殺菌后，外植體接種于MSi培養(yǎng)基14d以上，至誘導(dǎo)長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的抗性愈傷?？剐杂鷤D(zhuǎn)接于MSd培養(yǎng)基上約2～4周，誘導(dǎo)愈傷分化。分化后的外植體轉(zhuǎn)接于MSs培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)約2～4周，至長(zhǎng)出小莖。分化出小莖外植體轉(zhuǎn)接于MSe培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)至莖伸長(zhǎng)至約3～

5、4cm，并有數(shù)片真葉。長(zhǎng)好莖及葉片的小苗轉(zhuǎn)接于MSr培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)約4～8周，至長(zhǎng)出比較發(fā)達(dá)根系為止。馴化、寄栽和移栽后，進(jìn)行相應(yīng)分子檢測(cè)和性狀調(diào)查。 2.反義BnF3'H基因轉(zhuǎn)化中雙10號(hào)獲得一批轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株用根癌農(nóng)桿菌法，以下胚軸為外植體，采用前面所述的優(yōu)化方法，成功地將含有BnF3'H基因反義片段的T-DNA區(qū)段轉(zhuǎn)入了高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的油菜新品種中雙10號(hào)，獲得了16株抗卡那霉素的再生植株，通過(guò)PCR檢測(cè)和GUS染色，證明有

6、7株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，陽(yáng)性率為43.75％。證明外源T-DNA區(qū)段己經(jīng)整合入中雙10號(hào)轉(zhuǎn)基因植株的基因組中并具有表達(dá)活性。 3.反義抑制BnF3'H基因的表達(dá)后，油菜植株的花青素苷積累受到抑制對(duì)轉(zhuǎn)化反義BnF3'H基因的中雙10號(hào)的植株觀察發(fā)現(xiàn)，反義抑制BnF3'H基因?qū)χ须p10號(hào)植株外在性狀總體上沒(méi)有明顯影響，在沒(méi)有高溫和水份脅迫時(shí)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株的表面均沒(méi)有明顯的紫紅色花青素苷積累。但是，在自然氣候條件下并受到高溫干旱脅迫

7、時(shí)，非轉(zhuǎn)基因的陰性對(duì)照植株在較老的葉片上誘導(dǎo)產(chǎn)生了紅紫色的花青素苷，而轉(zhuǎn)基因植株則不明顯。初步說(shuō)明，采用CaMV 35S啟動(dòng)子組成性反義抑制BnF3'H基因的表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因油菜的花青素苷積累能力受到明顯的抑制。該結(jié)果一方面從油菜本身的轉(zhuǎn)基因角度，證明了本課題組所克隆的BnF3'H基因的確是參與花青素合成的類黃酮途徑的關(guān)鍵酶基因，也表明對(duì)該基因的操作可以修飾油菜諸如花青素苷在內(nèi)的類黃酮成份和植株性狀。這些轉(zhuǎn)基因植株中花色和種皮色素性狀是否