甘藍(lán)型油菜查爾酮異構(gòu)酶基因的反義轉(zhuǎn)化.pdf

1、油菜是世界四大油料作物之一，也是我國(guó)最重要的油料作物之一。甘藍(lán)型黃籽油菜與黑(褐)籽油菜相比，種子的含油量普遍較高，而且具有種皮薄、色素少、纖維素和多酚類物質(zhì)含量低、油質(zhì)清澈透明、蛋白質(zhì)含量高等一系列突出優(yōu)點(diǎn)。培育遺傳穩(wěn)定、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的黃籽甘藍(lán)型油菜已成為油菜育種的一個(gè)重要目標(biāo)之一。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)，能突破物種間的界限，轉(zhuǎn)移有用的基因，使可利用的基因資源大大拓寬，同時(shí)加快目標(biāo)性狀的定向選育，提高育種效率。但從目前甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)基因報(bào)道

2、情況看，均存在轉(zhuǎn)化效率不高的問題。 目前在擬南芥中已鑒定出21個(gè)透明種皮(Transparent testa，tt)基因位點(diǎn)和一個(gè)BAN位點(diǎn)，并且許多tt基因在擬南芥中已經(jīng)被克隆。 甘藍(lán)型油菜黃籽性狀形成的分子機(jī)理目前還不清楚，由于甘藍(lán)型油菜和擬南芥同屬于十字花科植物，親緣關(guān)系較近，因此，可以借鑒擬南芥透明種皮(Transparent testa，tt)性狀研究成果進(jìn)行甘藍(lán)型油菜籽粒色性狀的研究，以期闡明甘藍(lán)型油菜種皮顏

3、色形成的調(diào)控機(jī)制。 查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase，CHI，EC5.5.1.6)催化6’-羥基查爾酮轉(zhuǎn)變成5’-羥基黃烷酮，是類黃酮合成途徑中早期階段的關(guān)鍵酶也是第一個(gè)被認(rèn)識(shí)的類黃酮合成相關(guān)酶，在擬南芥中，CHI基因的突變(tt5)導(dǎo)致種皮由深褐色改變?yōu)辄S色，形成tt5突變體。研究油菜CHI基因有助于進(jìn)一步了解甘藍(lán)型油菜黃籽性狀形成的分子機(jī)制，為創(chuàng)造甘藍(lán)型黃籽油菜新品種提供基礎(chǔ)。 本研究利用含有CHI

4、基因反義表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)法轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜“華雙4號(hào)”下胚軸，通過組織化學(xué)法檢測(cè)報(bào)告基因GUS的表達(dá)情況，研究了卡那霉素篩選濃度、農(nóng)桿菌培養(yǎng)方式和預(yù)培養(yǎng)基激素配比對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響，這些影響因素的研究，以往報(bào)道很少。首次獲得了抑制CHI基因的轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)GUS組織化學(xué)染色檢測(cè)、PCR檢測(cè)和Southem檢測(cè)，確定CHI反義外源基因整合到了轉(zhuǎn)化植株基因組中。 主要結(jié)論和創(chuàng)新點(diǎn)如下： 1、篩選壓卡那霉素濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率

5、的影響將農(nóng)桿菌侵染共培養(yǎng)后的下胚軸接入不同kan濃度的篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10d后檢測(cè)GUS表達(dá)情況。結(jié)果表明，篩選壓濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率有明顯的影響，kan濃度在15mg/L時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高。 2、根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)方式對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響離心收集活化的農(nóng)桿菌，然后用不同的方式繼續(xù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌后用于侵染下胚軸。GUS表達(dá)檢測(cè)結(jié)果表明，用LB培養(yǎng)基活化后的農(nóng)桿菌再用添加AS的MS培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)6～24h對(duì)轉(zhuǎn)化有明顯的促進(jìn)作用；不同的農(nóng)桿菌培養(yǎng)方式對(duì)

6、轉(zhuǎn)化效率有明顯差異，在試驗(yàn)的6種農(nóng)桿菌培養(yǎng)方式中S2-5的轉(zhuǎn)化效果最好，即收集活化后的農(nóng)桿菌用MS+AS+抗生素重懸24h，再用MS+AS培養(yǎng)6h。這種能提高轉(zhuǎn)化效率的培養(yǎng)活化方式到目前為止，從來沒有深入研究和報(bào)道過，但其對(duì)優(yōu)化甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化體系有重要意義。 3、預(yù)培養(yǎng)基激素配比對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響將外植體在含不同2,4-D與6BA濃度的預(yù)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染。結(jié)果表明，2,4-D與6BA之間的相互作用對(duì)轉(zhuǎn)化有重要影響

7、；這種在預(yù)培養(yǎng)基中2,4-D與6BA相互作用對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響也是首次系統(tǒng)研究和報(bào)道。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)，在試驗(yàn)的預(yù)培養(yǎng)基激素組合中，2,4-D 2.00mg/L與6BA 0.25 mg/L的組合轉(zhuǎn)化效率是最高的。 4、轉(zhuǎn)化植株的檢測(cè)鑒定轉(zhuǎn)化再生植株經(jīng)GUS染色、PCR擴(kuò)增和Southern雜交鑒定，可確定外源CHI基因反義片段已整合到轉(zhuǎn)基因植株基因組中，表明轉(zhuǎn)基因是成功的，這是目前世界上首次利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將CHI基因反義片段導(dǎo)入