抗除草劑基因DsALS轉(zhuǎn)化擬南芥和甘藍(lán)型油菜的研究.pdf

1、油菜（Brassica napus）是我國(guó)繼大豆之后的第二大油料作物，提高油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)具有十分重要的意義。雜草是制約油菜生產(chǎn)的主要因素之一，嚴(yán)重降低油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前，利用化學(xué)除草劑是清除農(nóng)田雜草的主要方法，但是它在殺死雜草的同時(shí)也對(duì)農(nóng)作物的生長(zhǎng)造成了一定的影響。為了改良油菜抗除草劑的遺傳特性，本研究采用下胚軸作為外植體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將抗除草劑的乙酰乳酸合成酶基因轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜中雙9號(hào)和甲572，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，為選育抗除

2、草劑的油菜品種提供了育種材料。本研究的結(jié)果如下:
　　 1.從播娘蒿野生型和兩個(gè)抗苯磺隆除草劑的天然突變體中克隆了ALS基因（分別命名為DsALS-1、DsALS-97、DsALS-108，經(jīng)測(cè)序分析后與擬南芥中ALS序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)DsALS-97和DsALS-108序列中的197位的脯氨酸被分別替換為絲氨酸和蘇氨酸，這種突變會(huì)對(duì)ALS抑制劑產(chǎn)生抗性，而在DsALS-1序列中不存在相應(yīng)的突變。
　　 2.將克隆的三個(gè)

3、DsALS基因構(gòu)建植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥，利用T3代純合轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗性鑒定。轉(zhuǎn)DsALS-97和DsALS-108基因的植株對(duì)苯磺隆產(chǎn)生抗性，轉(zhuǎn)DsALS-1基因的植株不具有抗性，抗性鑒定結(jié)果與測(cè)序結(jié)果相一致。
　　 3.選用抗苯磺隆除草劑的基因DsALS-108，以Bar基因作為篩選標(biāo)記基因來(lái)構(gòu)建植物表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的下胚軸轉(zhuǎn)化法對(duì)甘藍(lán)型油菜中雙9號(hào)和甲572進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。以中雙9號(hào)為受體獲得23棵轉(zhuǎn)基因植株，陽(yáng)性

4、率為12.4％;以甲572為受體獲得19棵轉(zhuǎn)基因植株，陽(yáng)性率為22.4％。
　　 4.對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因株系隨機(jī)取樣提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果表明外源基因在T1代發(fā)生分離，且在轉(zhuǎn)基因后代中能夠穩(wěn)定遺傳。用RT-PCR檢測(cè)分析了T1代陽(yáng)性植株，從轉(zhuǎn)錄水平上證實(shí)了外源基因在轉(zhuǎn)基因后代中能夠穩(wěn)定表達(dá)。
　　 5.使未轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜致死的最低苯磺隆濃度為2.5×10-3g/L。用2.5×10-3g/L、5.0×10-3g/L和7