抗赤霉病相關(guān)基因轉(zhuǎn)化小麥及其抗病性分析.pdf

1、小麥赤霉病是由鐮刀菌引起的一種世界范圍內(nèi)廣泛流行的真菌病害。近年來，由于全球氣候變暖和耕作制度、耕作方式的改變，小麥赤霉病顯現(xiàn)逐年加重和大流行的趨勢，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。小麥赤霉病主要發(fā)生在穗期，造成穗腐，也可以在苗期引起苗枯、基腐等癥狀，它的發(fā)生不僅造成產(chǎn)量和品質(zhì)的下降，而且產(chǎn)生多種毒素，影響食品安全及人畜健康。
　　培育和推廣抗赤霉病的小麥品種，是控制小麥赤霉病的有效途徑。但是，由于小麥-鐮刀菌互作機(jī)制復(fù)雜，小麥品種天然抗

2、病資源稀少，抗性遺傳基礎(chǔ)狹窄，利用常規(guī)育種培育抗病且綜合性狀優(yōu)良的品種難度較大。基因工程育種技術(shù)的日趨成熟為解決這一難題提供了新的途徑。既可利用小麥天然抗源外，還可以充分利用其他植物、動物和微生物的抗病基因資源，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)造目標(biāo)性狀突出且綜合性狀優(yōu)良的抗赤霉病新品系，具有廣闊的發(fā)展與應(yīng)用前景。
　　本研究采用基因槍介導(dǎo)的最小表達(dá)框轉(zhuǎn)化法，將來源與抗性機(jī)制不同的抗赤霉病相關(guān)基因?qū)豚嶜?023，揚麥158以及揚麥15等我國小麥

3、主栽品種，旨在為小麥抗赤霉病轉(zhuǎn)基因育種創(chuàng)造新材料。主要結(jié)果如下:
　　1.以鄭麥9023為受體品種，成功導(dǎo)入了由大麥穎殼特異Lem2啟動子驅(qū)動的抗體融合蛋白Ech42CWP2。其中Ech42是一個來源于生防菌哈茨木霉的幾丁質(zhì)酶基因，CWP2是一個來源于雞的鐮刀菌特異單鏈抗體基因。由Lem2啟動子驅(qū)動的外源基因在轉(zhuǎn)基因小麥中仍保留著外稃/內(nèi)稃組織特異表達(dá)特性。分別對T3～T6代轉(zhuǎn)基因小麥進(jìn)行單花接種和自然接種鑒定，表明:轉(zhuǎn)基因株系Z

4、1和Z4在不同世代均具有穩(wěn)定的赤霉病抗侵入和抗擴(kuò)展能力。利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)對轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行毒素含量測定，結(jié)果表明其成熟籽粒毒素積累量也顯著降低。將獲得的轉(zhuǎn)基因株系Z1和Z4分別與感病品種華麥13進(jìn)行雜交，其雜交后代的赤霉病抗性也獲得了顯著提高。qRT-PCR分析表明Lem2啟動子驅(qū)動的Ech42CWP2基因受外源施加水楊酸(SA)上調(diào)表達(dá)，并且鐮刀菌的侵染能導(dǎo)致其表達(dá)水平有更大幅度的提高。因此，Lem2啟動子具有外稃

5、/內(nèi)稃組織特異表達(dá)和受鐮刀菌誘導(dǎo)表達(dá)的雙重特性，由其驅(qū)動的抗體融合蛋白Ech42CWP2能夠提高小麥的抗赤霉病能力。
　　2.以揚麥158為受體品種，成功導(dǎo)入了3個來源與抗性機(jī)制不同的抗赤霉病相關(guān)基因ZmGC、ACE和Ech42。這3個目的基因均由來源于玉米的組成型表達(dá)啟動子—Ubi啟動子驅(qū)動，其中ZmGC為玉米鳥苷酸環(huán)化酶;ACE是一種來源于洋蔥種子的抗菌肽;Ech42是一種來源于哈茨木霉的幾丁質(zhì)酶。通過不同世代的PCR，RT-

6、PCR以及Southern blot分析，檢測了轉(zhuǎn)基因的遺傳與表達(dá)穩(wěn)定性。與之前報道的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法類似，最小表達(dá)框轉(zhuǎn)化法獲得的轉(zhuǎn)基因植株（尤其在T3代以內(nèi)）也會出現(xiàn)隨機(jī)的轉(zhuǎn)基因遺傳不穩(wěn)定以及轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象。通過RT-PCR以及接種鑒定，篩選獲得了一個能穩(wěn)定遺傳與表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系Y3b-1，并且在T4～T7代均表現(xiàn)出穩(wěn)定的赤霉病抗性。此研究揭示了通過分子鑒定結(jié)合表型篩選，從中獲得目標(biāo)性狀突出的轉(zhuǎn)基因株系的重要性;還揭示了在植物中共表達(dá)各種來

7、源與抗性機(jī)制不同的抗病相關(guān)基因，可以實現(xiàn)多層次和多水平的持久抗性。
　　3.以鄭麥9023為受體品種，獲得了能穩(wěn)定遺傳的2個轉(zhuǎn)基因株系CZI和SZP。其中CZI株系含有2個目的基因HvChiCWP2和UEch42，SZP株系含有1個目的基因UEch42。HvChiCWP2和UEch42基因均由Lem2啟動子驅(qū)動，其中HvChiCWP2是由來源于大麥的幾丁質(zhì)酶HvChi和鐮刀菌特異單鏈抗體CWP2構(gòu)成的抗體融合蛋白;UEch42是經(jīng)

8、密碼子優(yōu)化后的Ech42基因。通過不同世代的PCR檢測表明:SZP株系于T4代達(dá)到純合;而CZI株系T1～T4代PCR陽性與陰性植株的分離比分別為1∶3.5，1∶3.2，1∶3.0和1∶2.4，呈現(xiàn)出異常分離的現(xiàn)象。對所獲得的T4代植株進(jìn)行單花接種鑒定，表明:與受體對照鄭麥9023相比，SZP株系的抗病性提高不顯著，CZI株系的抗赤霉病能力具有顯著提高。
　　4.以揚麥15為受體品種，獲得了能穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系SYP。該株系含有

9、2個目的基因AFP2CWP2和D4E1，均由Ubi啟動子驅(qū)動。其中AFP2CWP2是從蘿卜種子中分離獲得的一種抗菌肽AFP2和鐮刀菌特異單鏈抗體CWP2構(gòu)成的抗體融合蛋白;D4E1是一種人工合成的抗菌肽。通過不同世代的PCR檢測表明:SYP株系T1～T4代PCR陽性與陰性植株的分離比分別為1∶1.7，1∶1.5，1∶1.5和1∶1.2，也呈現(xiàn)出異常分離的現(xiàn)象。對所獲得的T4代植株進(jìn)行苗期接種與單花接種鑒定，表明:與受體對照揚麥15相比，

10、SYP株系的抗穗腐和抗苗腐能力均顯著提高。但遺憾的是，這個株系穗型發(fā)育不正常，具體原因還有待進(jìn)一步分析。
　　5.幾丁質(zhì)合成酶基因Chs3b是一個禾谷鐮刀菌生長發(fā)育致死基因，針對該基因cDNA序列的不同區(qū)段，將3個植物RNAi載體Chs3bRNAi-1，-3和-5共轉(zhuǎn)化揚麥15。對其T3～T5代轉(zhuǎn)Chs3bRNAi基因小麥株系L1和L3進(jìn)行接種鑒定，其抗苗腐和抗穗腐的能力均顯著提高。Northern blot檢測顯示轉(zhuǎn)Chs3bR

11、NAi基因株系能夠形成相應(yīng)的～21 nt小干擾RNA(siRNA)分子，并能夠有效的干擾入侵的禾谷鐮刀菌Chs3b基因的表達(dá)。共聚焦顯微觀察發(fā)現(xiàn):禾谷鐮刀菌接種后的轉(zhuǎn)Chs3bRNAi基因株系中菌絲生長受到了嚴(yán)重的抑制。因此，以禾谷鐮刀菌Chs3b基因為靶標(biāo)的宿主誘導(dǎo)的基因沉默(Host-induced gene silencing，HIGS)技術(shù)能夠有效提高小麥的赤霉病抗性。由于具有針對核苷酸序列的靶向特異性，這項技術(shù)為培育基于病原菌