小麥種子蛋白及赤霉病抗性相關(guān)基因的分子鑒定.pdf

1、依據(jù)功能不同可將種子蛋白劃分為貯藏功能的谷醇溶蛋白和維持正常代謝功能的非醇溶性蛋白兩類。高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)屬于種子醇溶性蛋白，優(yōu)質(zhì)HMW-GS可明顯改善小麥加工品質(zhì)。小麥近緣屬種中廣泛存在的HMW-GS等位變異基因可能成為小麥品質(zhì)改良的重要基因資源。麥類作物種子中還富含屬于種子非醇溶性蛋白中清蛋白的α-淀粉酶抑制因子(AAI)，能有效抑制內(nèi)源或外源α-淀粉酶活性，控制種子穗發(fā)芽、抑制昆蟲(chóng)繁殖。赤霉病是小麥主要病害之一，易

2、感染開(kāi)花期的小穗和發(fā)育早期的籽粒。赤霉菌會(huì)擾亂種子貯藏蛋白的合成或者消耗種子中的蛋白、糖來(lái)供自己繁殖，從而破壞發(fā)育中的籽粒。本文對(duì)小麥種子蛋白HMW-GS、AAI進(jìn)行了基因克隆、與進(jìn)化分析，并對(duì)抗赤霉菌材料的基因表達(dá)譜進(jìn)行了分子鑒定，主要結(jié)果如下： 1.從二倍體長(zhǎng)穗偃麥草中分離并鑒定了4個(gè)新型HMW-GS編碼基因，分別編碼x-型亞基(Ee2.1、Ee1.9)與y一型亞基(Ee1.8、Ee1.5)。其中，Ee2.1和Ee1.5各存

3、在1個(gè)與普通小麥HMW-GS相比特殊的Cys，推測(cè)這兩個(gè)亞基在小麥品質(zhì)育種中具有潛在利用價(jià)值。對(duì)小麥族不同物種HMW-GS的N-端序列進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，x-型和y-型HMW-GS均具有很高的同源性，但y-型HMW-GS變異程度比x-型亞基小。依據(jù)是否存在15bp或24bp的堿基插入將x-型HMW-GS及其編碼基因劃分為3種類型。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，HMW-GS編碼基因在漫長(zhǎng)的基因復(fù)制過(guò)程中相對(duì)獨(dú)立，且一直保持著其生物學(xué)功能。來(lái)自普通小麥A

4、、B、D基因組的HMW-GS存在明顯差異，具有染色體組特異性。 2.從普通小麥及近緣物種中克隆獲得與昆蟲(chóng)抗性有關(guān)的635個(gè)二聚α-淀粉酶抑制因子編碼基因(WDAI)，377個(gè)單聚α-淀粉酶抑制因子(WMAI)和20個(gè)四聚α-淀粉酶抑制因子(WTAI)編碼基因序列。對(duì)α-淀粉酶抑制因子序列與功能分析，探討了該家族成員間的理化、功能(如等電點(diǎn)、遷移率、對(duì)蛋白酶的抑制范圍和活性)差異的分子基礎(chǔ)。建立了一種利用序列中SNP位點(diǎn)開(kāi)發(fā)出特異

5、標(biāo)記引物將功能基因定位于普通六倍體小麥具體基因組的方法，由此將來(lái)自普通小麥的WDAI基因定位在3BS和3DS上。雖然從A基因組一粒系小麥中得到了WDAI、WMAI編碼基因序列，但分子證據(jù)揭示普通小麥A基因組不含有WDAI編碼基因，而是否含有WMAI編碼基因則需要進(jìn)一步研究。依據(jù)序列特征，推測(cè)小麥及其近緣物種中WDAI源于共同的祖先基因，而小麥及山羊草的WMAI也可能由一共同的祖先基因通過(guò)復(fù)制與突變進(jìn)化而來(lái)，但是WMAI相似性明顯比WDA

6、I高，變異程度更低。 3.依據(jù)序列分析發(fā)現(xiàn)二倍體一粒系小麥由于堿基插入導(dǎo)致無(wú)α-淀粉酶抑制因子活性的分子基礎(chǔ)。一粒系小麥中WDAI編碼基因差異與基因組來(lái)源有關(guān)，與地理來(lái)源關(guān)系不明顯。Am基因組的WDAI基因與Au基因組的基因相比進(jìn)化速率更慢、變異程度更低。依據(jù)普通小麥B基因組和擬斯卑爾托山羊草組S(S、Sl、Ss、Ssh“和Sb)基因組159個(gè)WDAI基因序列中SNP位點(diǎn)差異，共發(fā)現(xiàn)59種呈“星”形分布的單倍型，并可歸為5個(gè)主要

7、的單倍型組。普通小麥和野生二粒小麥B基因組上的WDAI基因與來(lái)自擬斯卑爾脫山羊草S基因組上的WDAI基因最相似，但是推測(cè)多個(gè)擬斯卑爾托山羊草組物種可能通過(guò)種間雜交時(shí)的基因漸滲參與了多倍體小麥B基因組WDAI基因位點(diǎn)的形成。小麥族11個(gè)屬20個(gè)基因組的WDAI基因的分子系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，WDAI編碼基因差異與基因組系統(tǒng)進(jìn)化有關(guān)，且在基因組分化以前該位點(diǎn)就已經(jīng)存在。這些結(jié)果為深入了解WDAI基因位點(diǎn)上基因重組、整合事件及發(fā)生過(guò)程提供了重要信

8、息，有助于加深對(duì)WDAI功能的了解。 4.對(duì)以色列野生二粒小麥α-淀粉酶抑制因子基因的遺傳結(jié)構(gòu)、分化程度及其與生態(tài)因子間的關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)研究。WMAI序列所包含遺傳信息較低；WTAI序列同樣非常一致。無(wú)論是在居群內(nèi)還是居群間，野生二粒小麥WDAI基因位點(diǎn)都存在變異，居群間遺傳距離與地理來(lái)源關(guān)系密切。野生二粒小麥WDAI基因序列ω值(Ka/Ks)大于1，表明該基因位點(diǎn)為正選擇位點(diǎn)，存在明顯的選擇壓力導(dǎo)致WDAI基因序列產(chǎn)生多樣性及

9、遺傳和功能差異。WDAI編碼基因中SNP標(biāo)記所揭示的16個(gè)居群遺傳多樣性指數(shù)(P)、Nei’s基因多樣性(He)和Shannon指數(shù)(I)分別為0.887、0.404和0.589。SNP服從于自然選擇，生態(tài)因子單獨(dú)或聯(lián)合作用導(dǎo)致WDAI基因序列中SNP位點(diǎn)的多樣性，特別是幾個(gè)水分因子對(duì)SNP位點(diǎn)有極顯著影響，推測(cè)水分作為主要選擇壓力通過(guò)影響昆蟲(chóng)數(shù)量間接影響α-淀粉酶抑制因子遺傳結(jié)構(gòu)變異、分化程度。 5.獲得與過(guò)敏性哮喘相關(guān)的小麥

10、種子潛在變應(yīng)原編碼基因。利用生物信息學(xué)手段對(duì)小麥種子蛋白質(zhì)變應(yīng)原與公認(rèn)主要變應(yīng)原α-淀粉酶抑制因子進(jìn)行了比較，并預(yù)測(cè)編碼蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)。由于過(guò)敏哮喘與由IgE介導(dǎo)的超敏反應(yīng)有關(guān)，推測(cè)這些蛋白質(zhì)具有能與IgE結(jié)合相似的結(jié)構(gòu)域。 6.對(duì)一套中國(guó)春.長(zhǎng)穗偃麥草附加系、代換系、端體異附加系材料的赤霉病抗性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)7E附加系(CS-7E)和7ES端體異附加系(CS-7ES)抗性最強(qiáng)，推測(cè)7E染色體上存在潛在的赤霉病抗性基因或能誘導(dǎo)

11、/抑制普通小麥CS上抗性/易感基因表達(dá)的調(diào)控基因。利用基因芯片對(duì)CS、CS-7E、CS-7ES在赤霉菌誘導(dǎo)0-96小時(shí)后的表達(dá)譜進(jìn)行了分析，初步篩選出70個(gè)赤霉病菌誘導(dǎo)差異表達(dá)的抗性相關(guān)基因：生物信息學(xué)比對(duì)和功能注解發(fā)現(xiàn)，候選基因所編碼蛋白質(zhì)或是屬于某些特定的生理生化代謝途徑關(guān)鍵酶、或是已知功能真菌誘導(dǎo)抗性應(yīng)答蛋白、或與生物或非生物脅迫應(yīng)答有關(guān)。利用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)16個(gè)候選基因的表達(dá)水平進(jìn)行了驗(yàn)證，與芯片數(shù)據(jù)相比基因表達(dá)水平變化的方向