小麥赤霉病Ⅱ型抗性機(jī)理研究及相關(guān)基因的功能鑒定.pdf

1、小麥赤霉病抗源極其有限，抗性種質(zhì)以II型（抗延展型）抗性為主。雖然前人對(duì)其抗病機(jī)理研究已經(jīng)開(kāi)展了大量工作，但是由于其本身的復(fù)雜性，目前對(duì)小麥赤霉病II型抗性的分子機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不清楚。本研究以最具代表性的赤霉病II型抗性小麥品種蘇麥3號(hào)為研究材料，首先對(duì)禾谷鐮刀菌侵染小穗不同階段取材進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)測(cè)定，并以此為研究基礎(chǔ)，分析赤霉病II型抗性的抗病機(jī)理，發(fā)掘抗病相關(guān)的抗病路徑，并結(jié)合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)其關(guān)鍵調(diào)控基因進(jìn)行驗(yàn)證。主要研究?jī)?nèi)容如

2、下：
　　1.接菌處理后0h、12h、24h、48h、72h和96h，分別取接菌穗及相鄰穗軸進(jìn)行RNA提取及cDNA文庫(kù)構(gòu)建，并通過(guò)Illumina HiSeq2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。利用中國(guó)春的基因注釋文件作為參考基因組，使用Hisat、Htseq和DEseq等分析軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較，尋找禾谷鐮刀菌處理不同時(shí)間后的差異表達(dá)基因。以Pval<0.05作為顯著差異表達(dá)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)處理不同時(shí)間材料之間的差異表達(dá)基因平均有

3、2287個(gè)，而且不同時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)基因的數(shù)目存在很大差異。通過(guò)GO注釋與富集、KEGG分析以及Mapman對(duì)差異基因進(jìn)行可視化處理。發(fā)現(xiàn)小麥在受到禾谷鐮刀菌侵染后，細(xì)胞壁合成修飾及降解、光合作用、磷酸化、糖代謝途徑、激素代謝和信號(hào)傳導(dǎo)以及去毒化過(guò)程的一些基因受到顯著調(diào)控。其中SA和JA激素合成及信號(hào)傳導(dǎo)途徑分別在禾谷鐮刀菌侵染前期和后期受到顯著調(diào)控，對(duì)其信號(hào)傳導(dǎo)通路上關(guān)鍵基因進(jìn)行表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，SA和JA均對(duì)小麥赤霉病產(chǎn)生響應(yīng)，但是SA

4、主要在禾谷鐮刀菌侵染0-24h產(chǎn)生響應(yīng)，而JA對(duì)赤霉病的響應(yīng)時(shí)間晚于SA。
　　2.為了驗(yàn)證SA和JA信號(hào)通路參與赤霉病抗病過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)對(duì)小麥穗部和葉片分別進(jìn)行了外源激素處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外源施加SA和MeJA可以提高小麥穗部赤霉病抗病能力，其中在感病材料中更加明顯；SA處理小麥葉片后，葉片的抗病能力提高，但是，MeJA處理反而降低了葉片對(duì)禾谷鐮刀菌的抵抗能力。說(shuō)明，SA可以提高小麥植株的整體赤霉病抗性，而JA在小麥穗部和葉片可能存

5、在不同的調(diào)控機(jī)制。
　　3. NPR1轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在模式植物中已經(jīng)驗(yàn)證為SA信號(hào)通路關(guān)鍵調(diào)控因子。為了明確SA和JA交叉反應(yīng)及其在赤霉病抗性中的作用，本研究對(duì)小麥NPR1基因進(jìn)行了表達(dá)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在小麥中TaNPR1可以受到禾谷鐮刀菌的正向調(diào)控，與JA信號(hào)通路的趨勢(shì)一致。而外源激素處理進(jìn)一步證實(shí)其受JA調(diào)控，不受SA響應(yīng)。另外，其同源基因TaNPR2和TaNPR3可以受SA和JA激素的雙重調(diào)控。說(shuō)明，NPR1在雙子葉植物中參與了

6、不同于單子葉植物的調(diào)控路徑，而且，SA和JA信號(hào)傳導(dǎo)路徑在單子葉和雙子葉植物中存在不同的調(diào)控機(jī)制。
　　4.為了進(jìn)一步確認(rèn)SA和JA的抗赤霉病功能，本研究利用BSMV-VIGS體系在小麥穗部對(duì)SA生物合成及信號(hào)傳導(dǎo)關(guān)鍵基因TaNPR1、TaOPR3和TaICS1等進(jìn)行沉默并進(jìn)行抗病性鑒定，結(jié)果表明TaOPR3和TaICS1基因被沉默后小麥的赤霉病抗性與空載對(duì)照相比顯著降低，發(fā)病小穗數(shù)明顯增多；而沉默TaNPR1基因后小麥赤霉病抗性

7、沒(méi)有發(fā)生很大的變化，說(shuō)明SA能夠顯著提高小麥赤霉病抗性，而TaNPR1基因可能不參與小麥的SA信號(hào)通路，而是通過(guò)其他信號(hào)路徑發(fā)揮抗病作用。
　　5.為進(jìn)一步深入研究SA的功能，本研究對(duì)禾谷鐮刀菌侵染小麥過(guò)程進(jìn)行了ROS染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接菌處理可以誘導(dǎo)接菌小穗ROS的產(chǎn)生，造成接菌穗的HR反應(yīng)，從而抑制病原菌的萌發(fā)和蔓延，提高小麥對(duì)赤霉病的抗延展能力。
　　6. DON是一種由赤霉菌產(chǎn)生的真菌毒素，它可以促進(jìn)病原菌在植物體內(nèi)的擴(kuò)

8、散。UGT家族成員能夠?qū)⒂坞x態(tài)的DON轉(zhuǎn)變成低毒力的D3G，但是目前還很少在小麥抗赤霉病研究中見(jiàn)到此類報(bào)道。本研究中根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)病原菌侵染后期大量的UGT基因被誘導(dǎo)表達(dá)，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個(gè)在抗赤霉病小麥品種中特異表達(dá)，而且對(duì)DON和禾谷鐮刀菌產(chǎn)生強(qiáng)烈響應(yīng)的UGT家族成員TaUGT5。該基因擁有一個(gè)1431bp的ORF，可以編碼476個(gè)氨基酸殘基；利用中國(guó)春缺-四體材料將其定位于2B染色體；在中國(guó)春參考基因組A、B和D

9、染色體組分別存在一個(gè)等位基因，但是只有2B染色體上的基因能夠表達(dá)；過(guò)表達(dá)TaUGT5轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對(duì)DON毒素表現(xiàn)出較高的耐受性；在小麥中過(guò)表達(dá)TaUGT5，轉(zhuǎn)基因植株的胚芽鞘抗赤霉病鑒定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株能夠有效地抑制禾谷鐮刀菌在胚芽鞘的蔓延速度；但是穗部和葉片的鑒定結(jié)果對(duì)赤霉病的抗性沒(méi)有在胚芽鞘中表現(xiàn)的那么明顯。亞細(xì)胞定位研究將TaUGT5編碼蛋白定位于細(xì)胞膜上，這可能與TaUGT5的生物學(xué)功能有關(guān)，該基因的編碼蛋白能夠減少DO