安徽小麥赤霉病菌菌群分布及產(chǎn)毒類型相關(guān)研究.pdf

1、小麥赤霉病(Wheatheadscab)是中國(guó)乃至世界小麥生產(chǎn)上的重要病害之一,本文以安徽省小麥產(chǎn)區(qū)所采集的小麥赤霉病菌為研究對(duì)象,著重從不同地區(qū)菌株菌群類型F.asiaticum和F.graninearumPCR-RFLP分子鑒定;菌群類型與前茬作物之間的關(guān)系;不同地區(qū)菌株產(chǎn)生毒素類型;探討RealTime-PCR定量檢測(cè)小麥赤霉病菌含量方法;主要研究結(jié)果如下:
　　1.安徽省小麥產(chǎn)區(qū)赤霉菌株的PCR-RFLP分子鑒定及分布圖繪

2、制
　　本文對(duì)2010-2013年期間采自安徽省小麥產(chǎn)區(qū)31個(gè)小麥赤霉病病穗進(jìn)行了小麥赤霉病菌株分離純化,同時(shí)對(duì)所有樣品進(jìn)行了DNA的提取[1]。樣品分別來源于安徽北部地區(qū):固鎮(zhèn)、利辛、亳州市、毛集、鳳臺(tái)縣、潁上縣、阜陽市、蒙城縣、太和縣、渦陽縣、懷遠(yuǎn)縣、宿州市、碭山縣;安徽中部地區(qū):巢湖市、定遠(yuǎn)縣、六安市、壽縣、金寨縣、霍邱縣、長(zhǎng)豐縣、明光市、含山縣、鳳陽;安徽南部地區(qū):宣州區(qū)、銅陵市、潛山縣、懷寧縣、安慶市、南陵縣、繁昌縣、蕪

3、湖市。
　　利用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,最后利用限制性內(nèi)切酶EcoiV和StyⅠ對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。結(jié)果顯示:在所有31株小麥赤霉菌株中,只有壽縣、碭山、蒙城、安慶菌株為F.graninearum,剩余27地菌株均為F.asiaticum。表明安徽省菌群類型以F.asiaticum為主,同時(shí)也有F.graninearum,但F.graninearum主要分布在皖北部地區(qū)。
　　2.小麥赤霉病菌種群類型與前茬作物旱作水作(水稻、

4、玉米)關(guān)系
　　本試驗(yàn)采用大樣本采樣,前茬作物玉米的采樣點(diǎn):蒙城縣、潁上十里鋪、潁上西三十里鋪、潁上六十里鋪;前茬作物水稻的采樣點(diǎn):懷遠(yuǎn)縣、潁上縣。各采樣點(diǎn)均分離、純化30個(gè)小麥赤霉菌菌株,共180個(gè)菌株。利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,最后用限制性內(nèi)切酶EcoiV和StyⅠ對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。結(jié)果顯示:前茬作物為玉米的四個(gè)采樣點(diǎn),分離的120個(gè)小麥赤霉菌菌株中出現(xiàn)17株F.graninearum,剩余全部為F.asiaticum

5、。F.graninearum菌株的檢出率為14.2％;前茬作物為水稻的兩個(gè)采樣點(diǎn),分離的60個(gè)小麥赤霉菌菌株中出現(xiàn)3株F.graninearum,剩余全部為F.asiaticum。F.graninearum菌株的檢出率僅為3.3%。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出,在相似生態(tài)區(qū)域內(nèi),前茬作物對(duì)小麥赤霉菌菌群分布有較大影響,前茬作物為玉米的F.graninearum檢出率較高。
　　3.安徽省小麥產(chǎn)區(qū)小麥赤霉產(chǎn)單端孢霉烯族毒素類型分三種,NIV、

6、DON(3-DON、15-DON)PCR-RFLP分子鑒定
　　本文對(duì)2010-2013年期間采自安徽省小麥產(chǎn)區(qū)31個(gè)小麥赤霉病病穗進(jìn)行了小麥赤霉病菌株分離純化,同時(shí)對(duì)所有樣品進(jìn)行了DNA的提取。
　　利用引物對(duì)1:上游ToxP1(5’-GCCGTGGGRTAAAAGTCAAA-3’)下游ToxP2(5’-TGACAAGTCCGGTCGCACTAGC-3’)
　　該引物對(duì)以小麥赤霉病菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到相

7、應(yīng)產(chǎn)物片段大小為360bp可判斷該菌株產(chǎn)生毒素類型為NIV.片段大小為300bp可判斷該菌株產(chǎn)生毒素類型為DON。具體為3-DON還是15-DON利用引物2,3分別判斷。
　　引物對(duì)2上游Tri303F(5’-GATGGCCGCAAGTGGA-3’)下游Tri303R(5’-GCCGGACTGCCCTATTG-3’)引物對(duì)3上游Tri315F(5’-CTCGCTGAAGTTGGACGTAA-3’)下游Tri315R(5’-GTCT

8、ATGCTCTCAACGGACAAC-3’)
　　利用引物對(duì)2,3分別對(duì)小麥赤霉病菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,只能擴(kuò)增出586bp大小片段的菌株可判斷該菌株產(chǎn)生毒素類型為3-DON,只能擴(kuò)增出864bp大小片段的菌株可判斷產(chǎn)生毒素類型為15-DON。
　　結(jié)果表明:蕪湖,潛山縣,巢湖市,霍邱縣,太和縣,銅陵地區(qū)菌株樣品產(chǎn)毒素類型為NIV,蒙城縣,碭山縣,壽縣,安慶菌株產(chǎn)毒素類型為15-DON,剩余各縣樣品產(chǎn)毒類型均為3-DON。

9、發(fā)現(xiàn)凡產(chǎn)毒素類型為15-DON的菌株在菌群分類檢測(cè)中均為F.graninearum。
　　4.RT-PCR檢測(cè)小麥赤霉病菌DNA含量標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
　　試驗(yàn)利用CTAB法提取小麥赤霉病菌菌株DNA作為模板。選取Tri5基因中特異引物:Tri5F5'-AGCGACTACAGGCTTCCCTC-3'Tri5R5'-AAACCATCCAGTTCTCCATCTG-3'
　　首先進(jìn)行普通PCR獲得500bp大小產(chǎn)物,利用天根膠回收

10、試劑盒進(jìn)行膠回收。采用核酸濃度測(cè)定儀(Thermal)測(cè)取濃度3.5ng/ul。隨后將回收后的DNA作為模板進(jìn)行梯度稀釋,濃度梯度為10,稀釋10000倍。之后,按照SYBR?PriemixExTaqTMII(TliRNaseHPlus,TaKaRa)建議體系加入染料和熒光定量PCR反應(yīng)試劑進(jìn)行熒光定量PCR,獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=-4.6953lg(x)+6.4496R2=0.9982。
　　5.南陵赤霉菌株的鑒定及相關(guān)生長(zhǎng)特性

11、研究
　　研究過程中發(fā)現(xiàn)一株菌落表型特異菌株,于是對(duì)該菌株進(jìn)行了ITS及PCR-RFLP分子鑒定,并同常見菌株進(jìn)行了相關(guān)生物特性的比較。通過分子生物學(xué)方法分別鑒定了其種屬類別。測(cè)定了其菌絲生長(zhǎng)速率,產(chǎn)色素量與產(chǎn)色素速度,產(chǎn)孢量與產(chǎn)孢速度及其致病力,同時(shí)完成該菌株與其他常見菌株的上述各測(cè)定量的對(duì)比。真菌ITS鑒定與PCR-RFLP鑒定結(jié)果表明該菌株確定為Fusariumasiaticum無疑,各測(cè)定指數(shù)如菌絲生長(zhǎng)速率,產(chǎn)孢量,致病力