小麥赤霉病相關(guān)基因的克隆及其特征研究.pdf

1、由禾谷鐮刀菌引起的赤霉病(Fusarium head blight or scab)是小麥(Triticum aestivum)和大麥(Hordeum vulgare)的重要病害，近年來，在黃淮海平原麥區(qū)和西北麥區(qū)也多次發(fā)生大流行，造成很大損失。禾谷鐮刀菌可侵染寄主植物的整個(gè)生長(zhǎng)周期，可引起種腐、苗腐、莖腐和穗腐，其中穗腐帶來的危害和損失最為嚴(yán)重，嚴(yán)重時(shí)甚至顆粒無收。而且赤霉病產(chǎn)生的多種衍生真菌毒素及次生代謝物質(zhì)能污染糧食作物種子，人畜

2、食用后還會(huì)引起嘔吐、腹瀉、頭昏等急性中毒現(xiàn)象，并可以在食物鏈中長(zhǎng)期存留，還可能產(chǎn)生致癌物質(zhì)，嚴(yán)重威脅著人和動(dòng)物的健康。因此，赤霉病不僅造成麥類產(chǎn)量的減少，而且食用價(jià)值也降低，也失去種用和工業(yè)價(jià)值。研究禾谷鐮刀菌和小麥宿主互作的分子機(jī)制，以及宿主小麥細(xì)胞內(nèi)病程相關(guān)基因的互作分子機(jī)制，探尋一些致病或抗病相關(guān)基因，將會(huì)對(duì)赤霉病的防治有著重要意義。
　　 本研究利用酵母雙雜交技術(shù)(Y2H)，和已經(jīng)建立的兩個(gè)抗赤霉病小麥品種蘇麥3號(hào)和望水

3、白的酵母cDNA表達(dá)文庫(kù)，進(jìn)行酵母雙雜交篩選。以禾谷鐮刀菌效應(yīng)因子(effector)木聚糖酶FGX(Fusarium graminearum endo-1，4-beta-xylanase NCBI登陸號(hào)AY575964)為誘餌蛋白在上述2個(gè)文庫(kù)中篩選相互作用蛋白，并以篩選到的蛋白為誘餌繼續(xù)進(jìn)一步的對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選。研究主要結(jié)果如下：
　　 一、克隆了禾谷鐮刀菌效應(yīng)因子(effector)木聚糖酶FGX，并將其克隆到酵母載體pGB

4、KT7上，構(gòu)建成誘餌載體 pGBKT7-FGX，為進(jìn)一步的雙雜交篩選奠定了基礎(chǔ)；
　　 二、利用構(gòu)建好的誘餌分別篩選小麥品種望水白和蘇麥3號(hào)的酵母表達(dá)文庫(kù)發(fā)現(xiàn)：在蘇麥3號(hào)的酵母表達(dá)文庫(kù)中篩選到了一個(gè)基因命名為S16，S16是一個(gè)含有FKBP-C2 superfamily結(jié)構(gòu)域的親免蛋白(immunophilin)。該基因ORF為339bp，編碼112個(gè)氨基酸，分子量為12 kDa，故命名為TaFKBP12(Trticum aes

5、tivumFK-506 binding proteins12 kDa)。在望水白酵母表達(dá)文庫(kù)中篩選到了兩個(gè)基因，分別是W1、67，分別克隆全長(zhǎng)后發(fā)現(xiàn)：W1氨基酸序列包含“RuBisCO-largesuperfamily domain”的保守結(jié)構(gòu)域，該基因ORF為1431bp，編碼含476個(gè)氨基酸殘基的蛋白，分子量為53 kDa，通過和NCBI上進(jìn)行氨基酸比對(duì)發(fā)現(xiàn)它是1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)，故命名為TaRub

6、isco53(Trticum aestivumribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase53kDa)。67屬于SCP-superfamily家族，是一個(gè)病程相關(guān)蛋白，根據(jù)已報(bào)道的序列在非翻譯區(qū)設(shè)計(jì)引物，我們成功克隆了該基因的全長(zhǎng)，它的ORF為498bp，序列分析表明該蛋白全長(zhǎng)為165個(gè)氨基酸，分子量18 kDa，故命名為TaSPRP18(Trticum aestivum SCPpath

7、ogenesis-related proteins18 kDa)。
　　 三、將TaFKBP12克隆到酵母載體pGBKT7上，構(gòu)建成誘餌載體pGBKT7-TaFKBP12。
　　 四、通過誘餌pGBKT7-TaFKBP12對(duì)以上兩個(gè)酵母文庫(kù)進(jìn)一步的雙雜交篩選發(fā)現(xiàn)：在蘇麥3號(hào)的酵母表達(dá)文庫(kù)中篩選到一個(gè)基因(編號(hào)S15)，克隆全長(zhǎng)后發(fā)現(xiàn)它是一個(gè)含有C2-superfamily結(jié)構(gòu)域的激發(fā)應(yīng)答蛋白，該基因全長(zhǎng)426bp，編碼含