馬卡小麥種子蛋白及基因研究.pdf

1、種質(zhì)資源是作物新品種選育的物質(zhì)基礎(chǔ)，將近緣屬種優(yōu)異基因資源轉(zhuǎn)入普通小麥一直受到育種工作者關(guān)注。馬卡小麥作為小麥族的種質(zhì)資源之一，收集并研究其各方面品質(zhì)特性對我國小麥的品質(zhì)改良有著一定的應(yīng)用價值。馬卡小麥含有優(yōu)質(zhì)面包等位基因，與普通小麥雜交能正常結(jié)實并產(chǎn)生生育能力正常的雜種后代，轉(zhuǎn)移基因容易。本文對來自格魯吉亞、匈牙利、前蘇聯(lián)、英國、美國、瑞士和瑞典等國家的29份馬卡小麥醇溶蛋白和高分子量谷蛋白的遺傳變異進行檢測，以期為進一步發(fā)掘和利用馬

2、卡小麥特異基因資源提供理論依據(jù)。并根據(jù)醇溶蛋白和LMW-Glutenin基因的N-端和C-端保守區(qū)設(shè)計特異性引物，采用PCR克隆的方法，對2份馬卡小麥的醇溶蛋白基因和LMW-GS進行深入分析，既了解馬卡小麥基因序列特征特性，同時也可發(fā)掘其中的優(yōu)異新基因，以期為小麥品質(zhì)改良提供理論依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 抗病基因的研究一直是小麥抗病蟲害研究的熱點，目前己有多個抗病基因從其它小麥轉(zhuǎn)入普通小麥中。但關(guān)于馬卡小麥抗蟲基因的研究和利用目前

3、國內(nèi)外尚未見報道，將α-淀粉酶抑制因子用于植物轉(zhuǎn)基因抗蟲，安全性好，更易于人們接受。本研究的目的就是對馬卡小麥α-淀粉酶抑制因子CM16基因進行分離克隆與序列分析，為篩選優(yōu)異抗蟲基因提供基礎(chǔ)。本研究主要內(nèi)容如下：
　　 一、種子貯藏蛋白A-PAGE和SDS-PAGE分析馬卡小麥是六倍體(2n=6x=42,AABBDD)栽培小麥，與普通小麥雜交能正常結(jié)實并產(chǎn)生有生育能力的雜種后代，確屬普通小麥遺傳改良的重要基因資源。本文對不同地理

4、來源的馬卡小麥種子貯藏蛋白進行了檢測與分析，主要結(jié)果如下:采用APAGE法檢測到馬卡小麥29份供試材料醇溶蛋白位點變異豐富。共有28種帶型和49條譜帶，每份材料可電泳分離出19-34條帶，平均25條。材料間遺傳相似系數(shù)變異范圍為0.29-0.95，平均值為0.61，表明馬卡小麥具有較豐富的遺傳多樣性。在0.58水平上明顯聚為3類，聚類結(jié)果與材料來源地沒有必然聯(lián)系。同時推測來自格魯吉亞的材料在醇溶蛋白等位變異上可能存在兩種主要類型。

5、>　　 利用SDS-PAGE法分析馬卡小麥高分子谷蛋白亞基(HMW-GS)組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其HMW-GS存在較豐富的亞基變異，共檢測到9種亞基類型和9種亞基組合.其中，GluA1位點上null亞基出現(xiàn)頻率最高(達82.8％)。Glu-B1位點上7+8為優(yōu)勢亞基(占53.3％),7+9亞基出現(xiàn)頻率也相對較高(23.3％)。Glu-D1位點上優(yōu)勢亞基為2+12(占82.8％)。供試材料品質(zhì)評分變幅為}-8分，平均為6.2分。更為重要的是，發(fā)

6、現(xiàn)4份材料同時具有7+8和5+10優(yōu)質(zhì)亞基，可供普通小麥品質(zhì)育種利用。
　　 二、醇溶蛋白基因的分子克隆和序列分析根據(jù)小麥族己知α-和γ-醇溶蛋白基因保守區(qū)設(shè)計引物，對馬卡小麥進行PCR擴增，成功獲得了2個α-醇溶蛋白基因Gli-Mα1，Gli-Mα2。Genbank登錄號分別為FJ595934和FJ595935;2個γ-醇溶蛋白基因Gli-Mr1，Gli-Mr2，Genbank登錄號分別為FJ595937和FJ595936，因

7、在編碼區(qū)內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了提前終止密碼子，故推測其都為假基因。馬卡小麥的2個α醇溶蛋白基因與來源于小麥屬普通小麥、烏拉爾圖小麥、野生種二粒小麥等的相應(yīng)基因進行比較發(fā)現(xiàn)它們在結(jié)構(gòu)上有著較高的相似性，同時也存在一定的差異，這些差異主要來源于氨基酸殘基以及重復(fù)區(qū)內(nèi)重復(fù)單元的替換、缺失和插入。一致性統(tǒng)計表明兩個α-醇溶基因同其它物種相應(yīng)基因的一致性在68.61％-96.46％范圍內(nèi)變化，兩個γ-醇溶蛋白基因與來源于小麥屬不同品種相應(yīng)基因之間同樣具有較高

8、的相似性，其一致性在77.71％-94.79％范圍內(nèi)變化。保守區(qū)進化分析表明，兩個α-醇溶蛋白各自聚為一類，Gli-Mα1與來源于普通小麥的醇溶的α醇溶蛋白親緣關(guān)系最近，而Gli-Mα2則與來源于Ⅴ染色體組的簇毛麥Dasypyrumbreviaristatum的α醇溶蛋白單獨聚為一類;兩個γ-醇溶蛋白同樣各自聚為一類，與來源于T.turgidumsubsp.dicoccoides的FJ006564的親緣關(guān)系最近，其次為Aeg,tausc

9、hii。Gli-Mr2與來自普通小麥品種的FJ006606的γ-醇溶蛋白親緣關(guān)系最近。
　　 三、LMW-GS基因的分子克隆和序列分析利用己知LMW-GS基因序列保守區(qū)設(shè)計引物對2份馬卡小麥基因組DNA進行擴增，成功克隆了2個LMW-GS基因Glu-LMl和Glu-LM2,Genbank序列號依次為FJ606796和FJ5995942。同小麥族其它LMW-GS基因進行比對分析后發(fā)現(xiàn)，其5'側(cè)翼序列和氨基酸序列同其它亞基存在較高的

10、一致性，同樣具備LMW-GS的典型特征，同時也存在著一定的結(jié)構(gòu)上的差異，這些差異主要來源與氨基酸殘基的替換以及重復(fù)區(qū)結(jié)構(gòu)單元的缺失或插入。在Glu-LMl基因序列側(cè)翼區(qū)發(fā)現(xiàn)1個順式作用元件EM(5'-TGTAAGT-3')。另外在2個基因種均出現(xiàn)2個TATAbox,Glu-LM1有3個3個CAATbox和2個AGGAbox，而Glu-LM2則有2個CAATbox和1個AGGAboxoGlu-LM1推導(dǎo)的氨基酸序列由20個氨基酸殘基組成的

11、信號肽，15個氨基酸殘基組成的N末端，一個由69個堿基組成的重復(fù)區(qū)和由172個氨基酸殘基組成的C端保守區(qū)。Glu-LM2的提前終止密碼子出現(xiàn)在重復(fù)區(qū)和CterⅡ區(qū)域，推測其為假基因。分子進化分析表明，馬卡小麥的Glu-LMl和與來源于小麥族的A和D染色體族的Aegilopstauschii和T.aestivum聚為一類。Glu-LM2與T.durum的親緣關(guān)系較近。
　　 四、CM16基因的分子克隆和序列分析馬卡小麥是普通小麥改