甘藍型油菜花和種子特異表達基因的篩選及啟動子鑒定.pdf

1、甘藍型油菜（Brassica napus）是我國最重要的油料作物，也是我國食用植物油的幾大來源之一。2009年起菜籽油就占我國油料作物產(chǎn)油的57％，但是國內(nèi)食用植物油自給率卻不到40%，而且南方冬閑田油菜含油量及產(chǎn)量較低、抗性較弱并且不適合機械化操作，所以分離出應(yīng)用價值較高的啟動子來提高油菜光合效率和抗性等性狀，擴大其種植面積與產(chǎn)量，對解決我國植物油問題具有重大意義。組織特異啟動子是調(diào)控基因在特定的器官或組織部位表達的啟動子，相較于組成

2、型啟動子驅(qū)動外源基因表達造成浪費及在特定部位表達量不足等缺點，具有極大優(yōu)勢，還能有效避免轉(zhuǎn)基因作物在種植中發(fā)生基因逃逸現(xiàn)象，對解決轉(zhuǎn)基因環(huán)境安全問題具有重大意義。所以，從甘藍型油菜中分離并鑒定出油菜自身組織特異性啟動子，研究其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機制，能為油菜和其近緣物種的基因功能研究及基因工程改良奠定基礎(chǔ)。本研究首先根據(jù)擬南芥基因芯片和白菜與甘藍表達譜數(shù)據(jù)，篩選在根、莖、葉、花和花蕾、角果皮、種子組織中特異表達候選基因，并利用實時熒光定量P

3、CR方法對候選基因進行組織特異性檢測和表達模式分析；其次，利用5'RACE技術(shù)獲得其準確的轉(zhuǎn)錄起始位點，通過同源克隆方法獲得SP3-1、SP6-1、ST-8-1、SC-2和FL-2啟動子序列，并利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫對其順式調(diào)控元件進行了預測和分析。最后，利用雙酶切技術(shù)構(gòu)建相應(yīng)的植物表達載體并通過農(nóng)桿菌介導法遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥，然后對轉(zhuǎn)基因植株進行PCR驗證并分析啟動子的表達強度和特異性。同時為了進一步研究甘藍型油菜花和種子的特異表達

4、基因，利用Illumina測序技術(shù)（基于RNA-seq），對甘藍型油菜品種中雙11的不同組織器官和不同發(fā)育時期的種子進行了轉(zhuǎn)錄組測序，分別將花和種子的轉(zhuǎn)錄組與其他組織器官轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進行比較分析，以及特異表達基因分析，篩選具有花和種子特異表達的候選基因。最后，分別從篩選出的種子和花特異表達基因中各選取10個基因，設(shè)計引物，進行定量PCR實驗，驗證并分析候選基因的特異性，為后續(xù)開發(fā)甘藍型油菜組織特異表達啟動子奠定了堅實的基礎(chǔ)。
　　本

5、研究主要內(nèi)容包括：⑴采用生物信息學分析方法從擬南芥基因芯片及白菜與甘藍表達譜數(shù)據(jù)中篩選鑒定了出10個組織特異表達的候選基因，從這10個候選基因中獲得了5個組織特異表達基因，qPCR分析結(jié)果表明SP3-1和SP6-1在莢果皮中特異表達、ST-8-1在莖中特異表達、SC-2在種皮中特異表達，F(xiàn)L-2在花器官中特異表達。通過對qPCR檢測片段、5'RACE末端及基因5'末端序列測序結(jié)果分析證實擴增片段是來自qPCR檢測為組織特異表達的候選基因

6、，啟動子的長度為1173-2400 bp（包含5'-UTR序列），轉(zhuǎn)錄起始位點分別位于翻譯起始位點上游53-269 bp，并包含核心啟動元件TATA-box及多個增強子元件CAAT-box，另外光響應(yīng)、脅迫響應(yīng)和激素響應(yīng)元件也廣泛存在于啟動子中。⑵克隆獲得的5個組織特異啟動子片段，分別是SP3-1（2151 bp）、SP6-1（1173 bp）、ST-8-1（2100 bp）、SC-2（2400 bp）和FL-2（1939 bp），利用

7、SalI和NcoI雙酶切將SP3-1、SP6-1、ST-8-1及FL-2分別亞克隆到具有相同酶切位點粘性末端的載體骨架pCAMBIA1305.1中，最終成功構(gòu)建了promoter-GUS載體p1305.1-FL-2P，p1305.1-ST-8-1P，p1305.1-SP3-1P和p1305.1-SP6-1P；同樣利用BamHI和NcoI雙酶切將SC-2替換pCAMBIA1305.1上的CaMV35S啟動子，得到植物表達載體p1305.1

8、-SC-2P，然后將構(gòu)建的植物表達載體成功轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株GV3101中，從而獲得其工程菌株。⑶將上述構(gòu)建成功的植物表達載體和p1305.1-FL-1P，通過農(nóng)桿菌介導法浸染擬南芥（col生態(tài)型）花序，成功獲得p1305.1-FL-1P轉(zhuǎn)基因陽性植株28株，p1305.1-SC-2P轉(zhuǎn)基因植株35株。將其培養(yǎng)至T3代，對轉(zhuǎn)基因植株進行了GUS蛋白活性及GUS基因表達模式分析，結(jié)果表明FL-1主要在花中表達，為花特異性啟動子；SC-2在種

9、子中不表達，不具有種子特異性。⑷使用高通量RNA-seq技術(shù)，獲得了所有甘藍型油菜基因在種子萌發(fā)48 h的根、下胚軸、子葉、花期的根、莖、葉、花和花蕾及花后5d、9d、30d、46d的種子和角果皮的表達（轉(zhuǎn)錄）水平。不同組織器官及不同時期的種子和角果皮樣品經(jīng)過高通量測序后得到高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)，通過生物信息學分析，得到了全基因組范圍的基因轉(zhuǎn)錄水平值FPKM（Fragments Per Kilobase of exon model per M

10、illion mapped reads）。篩選花和種子中最高表達量高于其他組織10倍以上的特異表達基因，得到花和花蕾特異基因1380個，種子特異基因2842個。利用Cytoscape中的BinGO對得到的特異表達基因進行GO富集分析，以校正后的P-Value從細胞組件本體、分子功能本體和生物過程對篩選得到的特異候選基因進行GO分類和富集分析，分別各取10個花和種子候選基因，用熒光定量PCR檢測其表達量，結(jié)果表明篩選的基因均為種子或花特異