煙草根特異表達(dá)基因的篩選鑒定與啟動(dòng)子的克隆.pdf

1、煙草作為一種特殊的經(jīng)濟(jì)作物，每年為國(guó)家經(jīng)濟(jì)發(fā)展作出重要貢獻(xiàn)。2007年煙草行業(yè)工商稅利超過(guò)3880億元，同比增長(zhǎng)25％。但是煙草生產(chǎn)上受許多病蟲(chóng)害的侵染而影響煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)。煙草青枯病是影響南方煙區(qū)發(fā)展的一個(gè)重要因素之一，而分子育種為解決煙草青枯病問(wèn)題開(kāi)辟了新的育種途徑。本研究采用了分子生物學(xué)、生物信息學(xué)技術(shù)和基因工程手段進(jìn)行煙草的分子育種研究：一是篩選和鑒定了一些煙草根特異表達(dá)的基因片段，二是通過(guò)同源克隆途徑分別克隆了煙草受病原菌誘導(dǎo)

2、的啟動(dòng)子，為煙草的分子育種提供基礎(chǔ)。其主要結(jié)果如下： 用地高辛分別標(biāo)記煙草莖葉和根的cDNA作為探針與根差異基因的高密度點(diǎn)陣膜進(jìn)行雜交，從根差異基因的驗(yàn)證結(jié)果中挑選了130個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序分析，其中發(fā)現(xiàn)有59個(gè)基因未找到與之同源性關(guān)系高的基因，并將其登錄NCBI，登錄號(hào)EX465336≈EX465278(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez)，另外71個(gè)基因在其它植物上有與之高度同源的基

3、因存在。在這130個(gè)基因中有19個(gè)基因存在明顯的差異，可能是根特異表達(dá)的基因。 利用RT-PCR方法初步鑒定篩選19個(gè)根差異基因片段，結(jié)果顯示基因3、5、14、16、18和19只在煙草的根中表達(dá)，其中基因18和19在根中的表達(dá)量豐富，基因3、5和14的表達(dá)量次之?；?、2、6、11和17在根、花和果實(shí)等器官中都有表達(dá)，其中基因17在煙草根中的表達(dá)量大于在花和果實(shí)中表達(dá)量?；?2和13在煙草的根和莖中都有表達(dá)，基因13在根和莖

4、中的表達(dá)量相當(dāng)，而基因12在根中的表達(dá)量小于在莖中的?；?在根、葉、花和果實(shí)中都有表達(dá)，以在根中的表達(dá)量最豐富。基因7、9和15在所有煙草器官中都有表達(dá)，不具有組織特異性。 以福建省特色烤煙品種翠碧一號(hào)葉片總DNA為模板，通過(guò)設(shè)計(jì)引物利用PCR方法分離出受細(xì)菌誘導(dǎo)啟動(dòng)子PP1和PP3。將PP1和PP3啟動(dòng)子構(gòu)建到克隆載體pGEM-T中并進(jìn)行測(cè)序。PP1啟動(dòng)子的長(zhǎng)度為1291bp，與GenBank上登錄的序列的同源性為99％；P

5、P3啟動(dòng)子的長(zhǎng)度為222 bp，與GenBank上登錄序列的同源性為99％。構(gòu)建了由啟動(dòng)子PP1和PP3驅(qū)動(dòng)的抗病基因(煙草幾丁質(zhì)酶基因、β-1，3-葡聚糖酶基因和花生胰蛋白酶抑制基因)的6個(gè)植物表達(dá)載體，分別命名為PPPP1、PPGP1、PPCP1、PPPP3、PPCP3和PPGP3。 本研究篩選鑒定出的根特異表達(dá)基因片段，為克隆根特異基因啟動(dòng)子奠定了基礎(chǔ)；構(gòu)建的6個(gè)含誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子與抗病基因的植物表達(dá)載體，可用于煙草抗青枯病