辣椒果實胎座特異表達基因啟動子序列的克隆及功能分析.pdf

1、辣椒是一種風(fēng)味蔬菜，不僅可以鮮食而且可加工成辣椒粉、辣椒醬等。此外，從辣椒中提取的辣椒素類物質(zhì)還可以用作生化農(nóng)藥、醫(yī)藥中的鎮(zhèn)痛劑等。辣椒素合成途徑相關(guān)基因啟動子的克隆與功能分析，不僅有助于從基因角度了解辣椒素類物質(zhì)的代謝過程，并能夠為實現(xiàn)基因調(diào)控辣椒素的生物合成提供必要的基因元件，具有十分重要的理論意義及應(yīng)用前景。 目前，韓國及美國的科學(xué)家已經(jīng)在辣椒素合成有關(guān)基因克隆方面進行了研究。韓國研究者從已知最辣的一種辣椒Habanero

2、(Capsicumchinense)中篩選到39個胎座特異的克隆，將它們分為四類：并預(yù)測GroupⅠ中的酶(?；D(zhuǎn)移酶和脂肪酸乙醇氧化酶)參與了辣椒素的生物合成。美國研究者Curry，Aluru等(1999，2003)，從Habanero(Capsicumchinense)胎座分離到幾個與辣椒素生物合成有關(guān)的cDNA克隆如Kas(AF085148)、pAMT(AF085149)等，而且這些克隆的轉(zhuǎn)錄是胎座特異的。 本研究利用根據(jù)

3、Kas基因、pAMT基因的mRNA設(shè)計的兩套特異性引物與16個隨機引物組合，以辣椒基因組DNA為模板對兩個基因的上游序列分別進行了TAIL-PCR擴增。在研究中，將TAIL-PCR條件進行優(yōu)化，共得到14個特異條帶，條帶大小大多在300-800bp，平均為591bp，最小的片段300bp，最長片段為1305bp。 TAIL-PCR擴增得到的片段與含GUS的植物表達載體連接，成功構(gòu)建了12個雙元植物表達載體。將表達載體轉(zhuǎn)入煙草，1

4、2種轉(zhuǎn)化植株均得到成活植株，其中有3個片段的轉(zhuǎn)化植株的幼苗葉片檢測到GUS表達。進一步將表達載體轉(zhuǎn)入辣椒，得到8種轉(zhuǎn)化植株，但在轉(zhuǎn)基因辣椒未檢測到GUS表達。 對8個成功轉(zhuǎn)入辣椒的表達載體所含片段進行了測序，有7個片段的序列與Genebank上的已發(fā)表序列相似性很低，應(yīng)為本研究克隆到的新序列。這8個序列片段都不同程度含有啟動子的結(jié)構(gòu)特征，如轉(zhuǎn)錄起始位點及調(diào)控元件TATA盒、CAAT盒等。對來自Kas基因的片段進行相似性比較，發(fā)現(xiàn)

5、有兩個片段相似性很高，尤其是轉(zhuǎn)錄起始位點及幾個調(diào)控元件，TATA盒、CAAT盒附近的序列幾乎完全相同，二者相似性達到75％以上。 本研究得到的擴增片段除來自Kas基因的3個片段能啟動GUS基因在煙草幼苗葉片中的表達外，其余片段在轉(zhuǎn)基因煙草和辣椒中都沒有表現(xiàn)出啟動子活性。因此，這些片段可能只是Kas和pAMT基因上游調(diào)控區(qū)域的部分序列，與調(diào)控活性密切相關(guān)的部分沒有擴增到。也可能是由于轉(zhuǎn)基因沉默等原因，導(dǎo)致這些片段不能啟動GUS基因