大豆貯藏蛋白基因啟動子的克隆與功能分析.pdf

1、目前，基因工程中存在的主要問題之一是外源基因的表達水平、表達部位等問題，因此，作為調控基因表達關鍵元件之一的啟動子的研究便成為基因工程研究的關鍵。根據啟動子的轉錄模式可將其分為三類：組成型啟動子(constitutive promoter)、組織特異性啟動子(tissue-specific promoter)和誘導型啟動子(inducible promoter)三種。迄今為止，植物表達載體中應用最廣泛的是CaMV 35S組成型啟動子，它

2、導致外源基因在轉基因植物的所有部位和所有發(fā)育階段都表達，不但造成能源的浪費還會引起植物的形態(tài)發(fā)生改變，影響植物的生長發(fā)育。這就使人們越發(fā)注重特異表達啟動子的研究和應用，特異性啟動子指導外源基因定向地在人們預定的時間和空間(組織或器官)表達，不僅能使目的基因的表達產物在一定空間積累，增加區(qū)域表達量，并且使外源基因的表達處于人們的控制之下，既保證了外源基因在植物體內的有效發(fā)揮又減少了對植物的不良影響。利用具有特異性表達特性的啟動子被認為是實

3、現對目標基因高表達的重要途徑，也是培育高效、安全轉基因作物的首選。 11S球蛋白是大豆種子中主要的貯藏蛋白，由多基因家族編碼，迄今為止已有七個大豆球蛋白基因被克隆、測序，分別是Gy1至Gy7。大豆種子貯藏蛋白具有種子特異性時序表達的功能，在種子成熟的中后期瞬時性的大量合成并貯存于種子蛋白體中。這種種子特異性時序表達的功能主要取決于種子貯藏蛋白基因上游調控序列，所以貯藏蛋白基因啟動子成為了研究高等植物基因特異性表達調控的首選材料。

4、我們以大豆品種“吉農T7018”的基因組DNA為模板，根據已發(fā)表11S球蛋白G7亞基(Gy7)基因(GenBankAF319776)序列，設計一對引物，通過PCR擴增得到Gy7基因的啟動子序列。將其克隆到pMD18-T Vector上，經大腸桿菌轉化后進行藍白斑篩選，挑取白斑堿裂解法提取質粒，進行PCR檢測和限制性內切酶酶切鑒定，鑒定后的菌株送交大連寶生物公司測序，并進行BLAST分析。測序結果表明所克隆的片段長為963bp，與預期設計

5、的大小一致，該片段與已發(fā)表的11S球蛋白基因啟動子序列的相似性為45.2％，但所含的啟動子序列元件的數量和距離上很相似，均具有有典型的TATA盒和CAAT盒，以及種子特異表達所必須的調控元件。 用該啟動子取代植物表達載體pBI121的CaMV35S啟動子，與GUS基因編碼區(qū)連接，獲得了由該啟動子驅動GUS報告基因的新型植物表達載體pGy-GUS。通過液氮凍融法將重組質粒pGy-GUS、質粒pBI121分別轉化到農桿菌LBA440

6、4中，采用葉盤法轉化煙草品種NC89。在含有 Kan 和Cef抗生素的MS選擇培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)，結果獲得6株轉pGy-GUS基因植株。對6株轉基因苗進行 PCR 檢測，以未轉基因的植株作為陰性對照，結果6株再生苗擴增出與目的片段大小一致的條帶。對PCR檢測呈陽性的轉基因植株進行Southern雜交檢測，雜交結果顯示有4株有明顯雜交信號，說明目的基因已成功整合到煙草基因組中。為了驗證所擴增的啟動子是否具有種子特異性表達的功能，我們對轉

7、pGy-GUS、pBI121質粒煙草的根、莖、葉、種子分別進行GUS組織化學分析。結果表明，轉pGy-GUS質粒煙草的根、莖、葉未顯色，而種子顯藍色，表現出明顯的種子特異性；而轉 pBI121質粒煙草的根、莖、葉、種子均顯藍色，由此初步得出結論：由該啟動子序列引導的GUS基因能在種子中表達，而在其它組織中未表達，證實該啟動子具有種子特異性表達的功能。本論文的完成為貯藏蛋白基因表達調控機制的研究提供理論依據，還可以在植物的特定部位或發(fā)育階