印度芥菜BjCET1基因的啟動(dòng)子克隆及其功能分析.pdf

1、隨著工農(nóng)業(yè)等人類(lèi)活動(dòng)的日益加劇，土壤和水體重金屬污染成為嚴(yán)重影響動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育以及人類(lèi)生命健康的重要因素。印度芥菜(Brassica juncea L)是一種重金屬超富集植物，對(duì)多種重金屬離子（如Zn、Cd、Co、Ni、Pb、Cs等）具有超富集能力，是植物修復(fù)技術(shù)的主要模式植物之一，可用于重金屬污染土壤的植物修復(fù)過(guò)程。本研究從印度芥菜中利用Genome Walking技術(shù)克隆了其CE家族蛋白基因BjCET1的啟動(dòng)子，命名為BjCET1P

2、。通過(guò)測(cè)序獲得其堿基序列并利用生物信息學(xué)方法對(duì)其功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)。同時(shí)，本研究利用農(nóng)桿菌侵染法獲得了擬南芥和煙草的BjCET1P轉(zhuǎn)基因植株。通過(guò)重金屬脅迫處理和GUS組織染色，對(duì)BjCEH1P轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了初步分析。取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.采用Genome Walking術(shù)克隆了BjCET1P啟動(dòng)子。根據(jù)PLACE啟動(dòng)子分析軟件分析得知，印度芥菜BjCET1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于翻譯起始密碼子ATG上游-215nt處，該序列除

3、包含啟動(dòng)子中心元件外，還包含多種功能元件如光應(yīng)答元件(CACGTG)、厭氧應(yīng)答元件(TGGTTT)、分生組織表達(dá)應(yīng)答元件(GCCACT)、脫落酸應(yīng)答元件(ACGTGGC，CACGTG)、抗旱應(yīng)答元件(TAACTG、CGGTCA)、低溫應(yīng)答元件(CCGAAA)、防御和脅迫應(yīng)答元件(ATTTTCTTCA)、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)元件(TTTCTTCTC)和光應(yīng)答元件(ATTAAT)等。
　　2.利用分子生物學(xué)技術(shù)成功構(gòu)建了pBI121-BjCET1

4、-1P-GUS，pBI121-BjCET1-2P-GUS、pBI121-BjCET1-3P-GUS真核表達(dá)載體，并進(jìn)行了擬南芥和煙草轉(zhuǎn)化，獲得了轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。
　　3.對(duì)野生型擬南芥和煙草及其pBI121-BjCET1P-GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草進(jìn)行非生物脅迫處理，并通過(guò)GUS組織染色分析BjCET1P在植株體內(nèi)的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子在擬南芥的根、莖、葉中都有表達(dá)，而在煙草中主要在根上部表達(dá)，且BjCET1P具有強(qiáng)啟動(dòng)本底和重

5、金屬誘導(dǎo)增強(qiáng)表達(dá)的特性。
　　4.本研究依據(jù)BjCRP1已知啟動(dòng)子序列經(jīng)同源克隆獲得印度芥菜一Cd響應(yīng)啟動(dòng)子，命名為BjCRP1P2。經(jīng)測(cè)序得知該啟動(dòng)子全長(zhǎng)1073bp，根據(jù)PLACE啟動(dòng)子分析軟件分析，該啟動(dòng)子除包含啟動(dòng)子中心元件外，還包含多種功能元件如脫落酸響應(yīng)元件(ACGTG)、與干旱誘導(dǎo)有關(guān)的MYB結(jié)合位點(diǎn)(WAACCA)、光誘導(dǎo)響應(yīng)元件(GCCAC)、調(diào)節(jié)類(lèi)黃酮（一類(lèi)植保素）生物合成元件(CNGTTR)、細(xì)胞分裂素調(diào)節(jié)基