薺菜冷響應(yīng)基因(COR15)及其啟動(dòng)子的克隆和功能分析.pdf

1、溫度是影響植物地域分布、生長(zhǎng)和發(fā)育以及農(nóng)作物質(zhì)量和產(chǎn)量的重要限制因子之一。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日益成熟，人們已從植物中分離了大批抗寒相關(guān)基因用于抗寒植物的培育。但利用抗寒相關(guān)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因抗寒植物培育時(shí)均發(fā)現(xiàn)在獲得優(yōu)良低溫抗性植株的同時(shí)，普遍出現(xiàn)不同程度的生長(zhǎng)延滯現(xiàn)象。主要是利用抗寒相關(guān)基因進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因植物都是在組成性啟動(dòng)子CaMV(cauliflower mosaicvirus)35S驅(qū)動(dòng)下產(chǎn)生的。這種基因的組成性表達(dá)對(duì)植物的生長(zhǎng)造成了一

2、定的影響。為了克服轉(zhuǎn)基因植物出現(xiàn)的生長(zhǎng)延滯現(xiàn)象，人們開始利用冷誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子代替組成性啟動(dòng)子。但目前有關(guān)冷誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子的研究還較少，為了獲得具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的冷誘導(dǎo)啟動(dòng)子，并明確該啟動(dòng)子的冷誘導(dǎo)特性，我們開展了薺菜冷調(diào)節(jié)基因(COR15)及啟動(dòng)子的克隆和功能分析，主要研究結(jié)果如下:
　　1.薺菜COR15b基因的功能研究
　　表達(dá)譜分析顯示CbCOR15b不僅在葉中表達(dá)，而且在根中也有表達(dá)。CbCOR15b-GFP載體

3、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化顯示在煙草葉肉細(xì)胞中CbCOR15b定位于葉綠體中，在不含葉綠體的洋蔥表皮細(xì)胞中定位于細(xì)胞質(zhì)中。將CbCOR15b基因通過(guò)葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，抗凍性分析結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草陽(yáng)性苗在4℃和-4℃條件下抗凍性增強(qiáng)，轉(zhuǎn)基因煙草電解質(zhì)滲透率升高的不及對(duì)照組快而且多，相對(duì)水含量比對(duì)照組降低的慢而且少，葡萄糖含量比對(duì)照組增加的快而且多。說(shuō)明CbCOR15b基因在細(xì)胞內(nèi)起了抗凍的作用。并且CbCOR15b過(guò)表達(dá)煙草植株沒(méi)有出現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)延遲現(xiàn)象，這

4、對(duì)應(yīng)用該基因于抗凍育種具有重要的意義。
　　2.薺菜COR15基因啟動(dòng)子的克隆和分析
　　采用genome-walking的方法克隆得到CbCOR15a和CbCOR15b基因的啟動(dòng)子，通過(guò)在線網(wǎng)站the PLANTCARE分析了順式作用元件。將CbCOR15b和CbCOR15a啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化煙草，通過(guò)RT-PCR分析和GUS染色分析顯示常溫下僅CbCOR15aP在煙草葉片和根中有較低活性，低溫處理后CbCOR15aP和CbCOR

5、15bP活性在葉片和根中的活性增強(qiáng)。與CbCOR15aP相比，CbCOR15bP具有強(qiáng)烈的冷誘導(dǎo)性，但在常溫時(shí)不具有活性，非常適合用于抗凍基因工程育種。
　　3.薺菜COR15基因啟動(dòng)子的缺失分析
　　根據(jù)CRT/DRE元件的數(shù)目，克隆了兩個(gè)啟動(dòng)子的缺失片段，將缺失片段與pCAMBIA1301載體上的GUS報(bào)告基因相連后轉(zhuǎn)化擬南芥，通過(guò)GUS染色分析顯示CRT/DRE元件確為冷響應(yīng)所必須，而且其數(shù)目多少影響啟動(dòng)子冷響應(yīng)的活性

6、。
　　4.薺菜和擬南芥COR15基因啟動(dòng)子的比較分析
　　為了分析擬南芥和薺菜COR15的啟動(dòng)子在低溫誘導(dǎo)下的活性，分別構(gòu)建了AtCOR15aP∷GUS, AtCOR15bP∷GUS, CbCOR15aP∷GUS和CbCOR15bP∷GUS四個(gè)載體轉(zhuǎn)化擬南芥，通過(guò)RT-PCR分析和GUS染色分析四種啟動(dòng)子冷響應(yīng)特性。結(jié)果表明常溫下CbCOR15aP在幼苗全株、成熟蓮座葉、莖生葉，花序和果莢中都有較低的活性，AtCOR15a

7、P在花藥中有活性，而CbCOR15bP和AtCOR15bP在常溫下沒(méi)有活性。四個(gè)啟動(dòng)子在低溫處理后活性都明顯增強(qiáng)，RT-PCR和GUS染色分析的結(jié)果表明4℃冷誘導(dǎo)1d后CbCOR15aP冷誘導(dǎo)活性最強(qiáng)，其次為CbCOR15bP，而AtCOR15aP和AtCOR15bP的冷誘導(dǎo)活性更弱，并且在擬南芥的根中沒(méi)有活性。
　　本研究圍繞CbCOR15b基因，對(duì)其啟動(dòng)子序列、啟動(dòng)子活性、蛋白定位以及功能分別做了研究，表明CbCOR15b是一