玉米DULL1和Shrunken1基因啟動(dòng)子的克隆與功能分析.pdf

1、在植物基因工程中，人們最常用的是組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)，該類啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中高效的表達(dá)。但是，這樣會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)和能量的負(fù)荷。所以我們采用組織特異性啟動(dòng)子就能控制外源基因在特定的組織或器中表達(dá)。本課題通過(guò)生物信息學(xué)分析結(jié)果，克隆了DULL1和Shrunken1兩個(gè)基因的啟動(dòng)子并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化對(duì)其表達(dá)特性進(jìn)行了分析，同時(shí)通過(guò)篩檢法對(duì)DULL1基因啟動(dòng)子進(jìn)行了進(jìn)一步的分析，確定其活性主要區(qū)域，獲得如下主要結(jié)果：<

2、br>　　1、通過(guò)PCR擴(kuò)增分別獲得DULL1和Shrunken1基因啟動(dòng)子，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這兩個(gè)基因啟動(dòng)子序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)啟動(dòng)子不僅含有基本的核心順式作用元件 TATA-box，而且 DULL1基因啟動(dòng)子還具有決定其在胚乳中特異表達(dá)有關(guān)的順式調(diào)控元件，如GCN4_motif、Skn-1_motif，均為胚乳表達(dá)必須的順式調(diào)控元件。
　　2、將DULL1、Shrunken1基因啟動(dòng)子與含有GUS報(bào)告基因的雙元表達(dá)載體pCAM

3、BIA1301連接，構(gòu)成兩個(gè)新型表達(dá)載體，通過(guò)水稻遺傳轉(zhuǎn)化，分別得到13株和9株轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)過(guò)GUS組織化學(xué)染色表明，DULL1基因啟動(dòng)子只在胚乳組織中表達(dá)，其他部位均不表達(dá)，說(shuō)明 DULL1基因啟動(dòng)子是一個(gè)胚乳特異性啟動(dòng)子。Shrunken1基因啟動(dòng)子在在根、莖、葉、葉鞘、穎殼中表達(dá)，在花和胚乳中不表達(dá)，說(shuō)明該啟動(dòng)子是個(gè)營(yíng)養(yǎng)器官特異表達(dá)啟動(dòng)子。
　　3、用5’端缺失法將DULL1基因啟動(dòng)子全長(zhǎng)缺失，得到四段不同長(zhǎng)度的缺失片段，

4、并將其轉(zhuǎn)入水稻，得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)過(guò) GUS組織化學(xué)染色，缺失片段PDU1-3和PDU1-4只在胚乳中表達(dá)，說(shuō)明這兩個(gè)缺失啟動(dòng)子也是胚乳特異性啟動(dòng)子，而PDU1-1和PDU1-2在任何組織中均無(wú)表達(dá)。根據(jù)GUS定量檢測(cè)，結(jié)果表明：DULL1基因啟動(dòng)子全長(zhǎng)的酶活性最高，PDU1-3和PDU1-4次之，PDU1-1和PDU1-2幾乎沒有酶活性，刪減實(shí)驗(yàn)證明不同長(zhǎng)度功能有差異，DULL1基因啟動(dòng)子活性主要區(qū)域在-740~-8bp之間，以該