鹽地堿蓬SsHKT1基因啟動子的克隆及功能分析.pdf

1、土壤鹽漬化是影響作物生長及產量的主要非生物脅迫，NaCl是引起鹽脅迫的首要因子，植物在鹽脅迫中保持高K+/Na+比對植物的耐鹽性有密切關系。植物HKT家族在植物耐鹽方面的作用受到廣泛關注。目前關于擬南芥、小麥、水稻等非鹽生植物HKT1的研究很多，主要認為植物中HKT1蛋白在植物體內Na+運輸和Na+穩(wěn)態(tài)維持中起到重要作用。近年來，鹽生植物耐鹽機制的研究也受到越來越多的重視。對于鹽芥、鹽地堿蓬等鹽生植物HKT1的研究也有了一定進展，研究表

2、明，鹽生植物HKT1蛋白更傾向于K+的吸收，這與非鹽生植物HKT1蛋白明顯不同。研究鹽生植物HKT1對于進一步揭示植物耐鹽機制有重要作用。
　　本實驗室采用真鹽生植物鹽地堿蓬為材料已經克隆了SsHKT1，證明SsHKT1運K+而不運Na+，SsHKT1表達受低K+和NaCl處理誘導，而且SsHKT1表達在高鹽處理下保持高水平。為了探討SsHKT1調控的分子機理及SsHKT1在植物耐鹽方面的作用，本實驗克隆了SsHKT1啟動子，對啟

3、動子特性及活性進行了初步探索，另外還對鹽地堿蓬SsHKT1在水稻中的功能進行初步研究，主要研究結果如下:
　　1.SsHKT1基因啟動子序列的擴增
　　根據(jù)已發(fā)表的SsHKT1 cDNA序列，設計了一系列嵌套的特異性引物，以鹽地堿蓬基因組DNA為模板，經三次TAIL-PCR后克隆得到啟動子序列1044 bp，經BLAST比對后確定序列為鹽地堿蓬SsHKT1啟動子序列。
　　2.SsHKT1基因啟動子的序列元件分析

4、>　　用PLACE和PlantCARE對啟動子序列進行分析，結果表明啟動子序列中除含有TATA-box、CAAT-box等啟動子典型順式調控元件外，還含有一些重要的順式調控元件:如NaCl誘導元件GT-1、防御和逆境響應元件TC-rich repeats、光誘導相關元件GATA-box和G-box、分裂組織表達相關元件CAT-box、胚乳特異相關元件Skn-1-motif等特異性表達元件。
　　3.SsHKT1基因啟動子的活性及表

5、達分析
　　用BamHⅠ和PstⅠ雙酶切SsHKT1啟動子，導入含有GUS表達基因的PCAMBIA1391載體中，取代載體中的35 S啟動子，構建了SsHKT1啟動子-GUS載體。
　　將載體轉入農桿菌EHA105中，選取陽性克隆轉化煙草葉片，對葉片進行GUS組織化學檢測。結果表明，鹽地堿蓬SsHKT1啟動子能夠驅動GUS基因在煙草葉片中表達，證明SsHKT1啟動子具有啟動子活性。
　　用含有SsHKT1啟動子-GUS

6、載體的農桿菌侵染擬南芥花序，用50 mg/L的潮霉素對擬南芥種子進行篩選。對篩選出的抗性植株進行GUS染色分析，結果顯示GUS基因主要在擬南芥的維管組織中表達。
　　4. SsHKT1基因轉化水稻分析
　　將成熟的水稻種子置于NBD2培養(yǎng)基，誘導出的愈傷于NBD0.5培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)。將PROKⅡ-SsHKT1質粒轉化農桿菌EHA105，取陽性克隆侵染水稻愈傷組織。用50 mg/L的G418試劑對愈傷進行篩選，獲得抗性愈傷。