鹽地堿蓬4，5-多巴雙加氧酶基因的克隆和功能分析.pdf

1、鹽地堿蓬是一種葉肉質(zhì)化的稀鹽鹽生植物。鹽地堿蓬在濱海的潮間帶或者部分澇洼積水地帶在整個(gè)生長(zhǎng)期植株地上部分皆為紫紅色，而在地勢(shì)較高或者距離海邊較遠(yuǎn)的地方植株則呈現(xiàn)綠色。作為一種真鹽生植物，鹽地堿蓬的耐鹽機(jī)理已得到了比較廣泛的研究。且已證明鹽地堿蓬中的紅色素為甜菜紅素。但是，鹽地堿蓬中甜菜紅素積累的生物學(xué)意義至今尚未見報(bào)道。目前甜菜素合成的分子機(jī)理和相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控也不明晰。甜菜素合成途徑相關(guān)酶的功能定位、特性分析、基因克隆以及相關(guān)基因表

2、達(dá)調(diào)控的研究也是需要深入的領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)克隆了合成甜菜紅素的關(guān)鍵酶之一——4,5-多巴雙加氧酶的基因和啟動(dòng)子，研究其表達(dá)特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究甜菜紅素在鹽生植物進(jìn)化和生態(tài)適應(yīng)等方面的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。 研究結(jié)果如下： 1.鹽地堿蓬DODA基因克隆及序列分析 根據(jù)GeneBank中已知的DODA基因的cDNA和蛋白序列尋找保守區(qū)以合成簡(jiǎn)并引物，以鹽地堿蓬總RNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增獲得500 bp的保守片段；B

3、LAST分析表明該片段與其它植物DODA同源性較高，初步確定為鹽地堿蓬DODA基因序列；根據(jù)該序列設(shè)計(jì)用于3’-RACE和5’-RACE的基因特異性引物，分別擴(kuò)增得到350 bp的3’-末端和250 bp的5’-末端；將三段序列進(jìn)行拼接，獲得鹽地堿蓬基因DODA的全長(zhǎng)，進(jìn)而設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增獲得其全長(zhǎng)。SsDODA cDNA序列全長(zhǎng)1030 bp，包括71 bp的5’-非編碼區(qū)和146 bp的3’-非編碼區(qū)。開放閱讀框?yàn)?13 bp，編碼27

4、1個(gè)氨基酸殘基，分子量約30.4kDa。BLAST分析表明鹽地堿蓬4,5-多巴雙加氧酶與來源于其他物種的4,5-多巴雙加氧酶具有較高的序列相似性，與Beta vulgaris在氨基酸水平上具有80％的序列一致性。 2.植物表達(dá)載體pROKII：：SsDODA的構(gòu)建 經(jīng)Xba I和BamH I酶切的pMD18-T：：SsDODA和pROKII載體通過T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)經(jīng)PCR以及酶切鑒定確定為重組質(zhì)粒，且外

5、源片段方向正確，命名為pROKII：：SsDODA。 3.轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選 pROKII：：SsDODA轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，陽性克隆侵染擬南芥。在50 mg/L卡那霉素的篩選壓下，獲得約100株抗性苗。轉(zhuǎn)化株自交以獲得純合的轉(zhuǎn)基因株系。 4.SsDODA啟動(dòng)子的分離和功能預(yù)測(cè) 使用TAIL-PCR法首次成功地從鹽地堿蓬基因組中克隆了4,5-多巴雙加氧酶基因SsDODA的啟動(dòng)子片段。使用PLACE數(shù)據(jù)

6、庫對(duì)500bp的SsDODA啟動(dòng)子片段進(jìn)行順式作用元件分析，結(jié)果表明啟動(dòng)子序列中除了TATA-motif、CAAT-motif等典型的真核生物順式調(diào)控元件外，還含有其他重要的順式調(diào)控元件如光反應(yīng)元件：-10PEHVPSBD，I box；低溫響應(yīng)元件LTR；脫水應(yīng)答元件MYCCONSENSUSAT等。 5.植物表達(dá)載體pBII21：：SsDODA-P的構(gòu)建 HindⅢ和BamH I雙酶切pBII21質(zhì)粒，去掉約0.8kb的

7、35S啟動(dòng)子片段，回收大片段，并與同樣經(jīng)HindⅢ和BamH I雙酶切的SsDODA啟動(dòng)子片段連接，構(gòu)建成與報(bào)告基因GUS融合的植物表達(dá)載體pBII21：：SsDODA-P。 6.SsDODA啟動(dòng)子的GUS活性檢測(cè) 將植物表達(dá)載體pBII21：：SsDODA-P轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105，陽性克隆轉(zhuǎn)化煙草，GUS組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，鹽地堿蓬SsDODA啟動(dòng)子片段能夠驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GUS在煙草葉片中表達(dá)，證明克隆得到的Ss