水稻W(wǎng)RKY基因的克隆和功能分析.pdf

1、植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族在植物抗逆反應中起著廣泛而重要的調(diào)控作用。為了探討水稻轉(zhuǎn)錄因子基因(Os WRKY)在水稻應對生物脅迫和非生物脅迫中所擔負的獨特生物學功能，我們通過反轉(zhuǎn)錄PCR方法克隆獲得OsWRKY19、OsWRKY21、OsWRKY45；OsWRKY24、OsWRKY30、OsWRKY70；OsWRKY28、OsWRKY62、OsWRKY71、OsWRKY76；OsWRKY1、OsWRKY97這四個亞組12個基因的全長cDN

2、A序列。然后，分別構(gòu)建完成相應基因的植物過量表達載體12個和RNAi基因沉默載體12個，用于水稻轉(zhuǎn)化實驗。并且，應用實時熒光定量PCR技術(shù)初步分析了上述OsWRKY基因在7種逆境因子脅迫下的基因表達譜，結(jié)果表明：OsWRKY19、OsWRKY45、OsWRKY62和OsWRKY76的表達受水楊酸和BTH誘導都能顯著上調(diào)，OsWRKY28經(jīng)茉莉酸誘導后表達顯著上調(diào)，OsWRKY24和OsWRKY70的表達受冷脅迫上調(diào)明顯。 對Os

3、WRKY21基因表達譜進行了更廣泛的分析，發(fā)現(xiàn)低pH值的模擬酸雨(AR2.5-3.5)處理能夠強烈地誘導OsWRKY21的表達。繼而，對OsWRKY21轉(zhuǎn)基因植株進行了酸雨耐受試驗，離體葉片檢測表明：用低pH值A(chǔ)R溶液處理時，T1代過量表達植株比野生型植株更能抵抗酸雨的傷害，而T1代RNAi植株則比野生型植株更易受酸阿的傷害。進一步使用低pH值A(chǔ)R溶液噴施T2代轉(zhuǎn)基因純系植株，葉面酸蝕斑面積的統(tǒng)計分析再次證明OsWRKY21過量表達能夠

4、顯著提高水稻對酸雨的抵抗能力，而OsWRKY21基因沉默導致水稻對酸雨耐受力明顯下降。這些結(jié)果顯示OsWRKY21在水稻應對酸雨脅迫過程中起著重要的正調(diào)控作用。此外，干旱實驗也表明OsWRKY21過量表達可以增強水稻對干旱的耐受性。 為尋找OsWRKY21調(diào)控的下游靶基因，我們采用pull down技術(shù)獲得OsWRKY21蛋白結(jié)合的DNA片段，經(jīng)測序確認基因信息后，選擇其中48個基因進行RT—PCR篩選，繼而使用Real—tim

5、e PCR技術(shù)推斷一個胚胎形成跨膜蛋白(embryogenesis transmembrane protein，ETP)和一個受體蛋白激酶CLAVATA1(receptor protein kinase CLAVATA1，RPKC)為OsWRKY21調(diào)控的下游靶基因。OsWRKY21能夠激活胚胎形成跨膜蛋白的表達并抑制受體蛋白激酶CLAVATA1的表達。 綜上所述，本論文對12個OsWRKY基因的克隆、載體構(gòu)建和表達譜分析為后續(xù)