化學誘導啟動子的克隆、定點突變及功能分析.pdf

1、調控基因表達的化學誘導系統(tǒng)在基因功能鑒定及植物生物工程方面具有廣泛的應用價值.植物受到病原菌侵染后,感染部位產生過敏性壞死反應,在其它部位產生系統(tǒng)獲得性抗性并伴隨抗性基因包括病程相關蛋白(Pathogen-Related protein)基因的表達.其中一個PR基因PR-1a,不僅受病原菌誘導,而且受一些化學劑如SA、BTH等化學劑的誘導,其誘導應答由其啟動子控制,因此PR-1a啟動子可以應用于植物化學誘導系統(tǒng)中.根據(jù)PR-1a基因的報

2、道序列,設計兩對引物,以煙草基因組為模板,通過PCR擴增得到900bp(IPl)和603bp(IPs)兩個目標片段,序列測定表明克隆的啟動子與報道序列具有99％的同源性,轉錄起始位點、TATA box及保守序列TGAC與報道序列均完全相同.通過PCR方法對克隆的兩個啟動子進行定點突變,使轉錄起始位點上游-137bp處A突變?yōu)镃,得到兩個突變啟動子(IPMl、IPMs).將花藥盒元件插入突變位點,得到兩個修飾的化學誘導啟動子(IPMal、

3、IPMas).為了檢測得到的啟動子驅動效率及誘導活性,將所得到的啟動子、定點突變啟動子和插入花藥盒的啟動子與GUS基因連接,構建了6個植物表達載體,同時分別構建包含IPl::barnase、IPMl::barnase、IPMal::barnase嵌合基因的植物表達載體.將前6個表達載體導入煙草,得到大量經Southern雜交驗證的轉基因植株.用SA和BTH處理轉基因煙草植株誘導GUS基因的表達,結果表明:1.全長900bp啟動子能夠應答

4、SA和BTH的誘導,而603bp長的啟動子無論突變與否對SA和BTH均無應答,證明SA和BTH的應答區(qū)域在克隆啟動子的轉錄起始位點上游575~872bp之間.2.在轉錄起始點上游137bp定點將A突變?yōu)镃后,對化學啟動子的化學誘導應答性沒有明顯的影響,但對誘導效應的向上運輸存在一定程度的阻抑作用.3.在克隆的化學誘導啟動子中適當位點插入花藥盒可以使誘導應答集中于花藥,從而使天然的化學誘導性啟動子變成人工花藥特異性啟動子.4.化學誘導劑B

5、TH的誘導效率高于SA,且在有效誘導濃度范圍內對植株沒有生理毒性或所產生的生理毒性難以從表象觀察到.5.BTH能系統(tǒng)誘導PR-1a野生型啟動子驅動GUS基因在轉基因植株的葉、花藥、萼片及成熟花粉中表達,而SA的誘導作用則具有某種時空局限性.6.BTH在葉片中系統(tǒng)誘導時間為施藥后的15天,誘導作用可以持續(xù)25天以上,而且誘導效應沿主莖上下運輸,而SA僅誘導處理部位的基因表達.7.1.2mM以下濃度范圍內,隨著濃度的增加,SA在植株中的運輸