枯草芽孢桿菌啟動子的克隆及功能分析.pdf

1、枯草芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性菌，廣泛應用于蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的工業(yè)化生產(chǎn)，是重要的工業(yè)菌種?？莶菅挎邨U菌具有分泌蛋白能力強、非致病性、同時易于分離培養(yǎng)，遺傳背景較清晰等特點，在基因工程是一種表達和分泌外源蛋白的理想宿主。實踐表明目前枯草芽孢桿菌的載體系統(tǒng)常用的啟動子不能滿足越來越多外源基因表達的要求，因此篩選新型強啟動子或者通過改造啟動子以期實現(xiàn)外源基因的高效表達。
　　利用本研究所構建的探針型質(zhì)粒載體PUC-kana直接在大腸

2、桿菌中篩選啟動子，并獲得了具有啟動子活力的PK3片段，以麥芽糖α-淀粉酶基因sva為報告基因構建pHCMC04-Pk3-sva重組質(zhì)粒，導入B.subtilis1A857菌株中進行表達，結果表明PK3片段在枯草芽孢桿菌中能使sva基因成功表達，通過測定胞外發(fā)酵液粗酶活力為27.3 U/mL。
　　為了研究人工雙啟動子的轉(zhuǎn)錄功能，利用來自枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的啟動子PaprE和胞苷脫氨酶(cdd)基因的啟動子P43，分別構建了麥芽

3、糖α-淀粉酶sva基因為報告基因的pHCMC04-PaprE-sva、pHCMC04-P43-sva、pHCMC04-P43-PaprE-sva和pHCMC04-PaprE-p43-sva表達載體，然后分別轉(zhuǎn)化B.subtilis1A857感受態(tài)細胞，不同時間取樣測定麥芽糖α-淀粉酶sva酶活并比較其酶活力，結果顯示重組菌B.subtilispHCMC04-PaprE-sva、 pHCMC04-p43-sva、pHCMC04-P43-P

4、aprE-sva和pHCMC04-PaprE-P43-sva表達的sva酶活分別為69.4 U/mL，79.7U/mL，97.6 U/mL，121.8 U/mL，菌體密度OD600值分別為8.6、9.03、9.5、9.3。表明雙啟動子較單個啟動子表達量均有所提高，串聯(lián)組合P43-PaprE較單啟動子提高1.2倍，串聯(lián)順序為PaprE-p43酶活較單個啟動子提高1.6倍，串聯(lián)組合P43-PaprE與單個啟動子相比差距不顯著，PaprE-p

5、43組合效果最佳。相較于組成型啟動子而言，誘導型啟動子具有可控性強的優(yōu)勢，適合用于對表達調(diào)控要求嚴格的外源基因表達。根據(jù)上述實驗結果，嘗試獲得更高效的誘導型表達載體。以本實驗室構建好的pHCMC04-Pglv-sva為骨架，構建重組質(zhì)粒pHCMC04-P43-Pglv-sva和pHCMC04-Pglv-p43-sva分別轉(zhuǎn)化到B.subtilis1A857感受態(tài)細胞進行發(fā)酵培養(yǎng)。結果顯示，添加1.5％麥芽糖后，重組菌pHCMC04-Pg