枯草芽孢桿菌NCD-2群體感應系統comQ基因的克隆和功能分析.pdf

1、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)NCD-2菌株能有效的防治棉花黃萎病,明確其生防作用機理將有助于提高其生防效果。本研究對影響B(tài).subtilis NCD-2菌株遺傳轉化的因素進行摸索并對其轉化條件進行優(yōu)化,建立了該菌株的高效電擊轉化體系。通過比較5個不同大小和攜帶不同來源復制子的質粒對其轉化效率的影響,發(fā)現質粒大小與NCD-2菌株的電擊轉化效率之間沒有明確的相關性；而攜帶來源于B.coagulans復制子的質粒pNW3

2、3N時,NCD-2菌株的電擊轉化效率最高,可以達到3.6x104cfu·μg-1DNA,說明復制子來源是影響轉化效率的一個重要因素。采用pNW33N質粒在不同電阻、電場強度及培養(yǎng)時間下的電擊轉化效率的研究結果表明,該菌株轉接到生長培養(yǎng)基后,37℃、150 r·min-1培養(yǎng)3.5h,在電阻值200Ω、電場強度14.0kV·cm-1的條件下轉化效率最高,能夠達到6.1×104cfu·μg-1DNA。優(yōu)化后的轉化體系為順利開展B.subti

3、lis NCD-2菌株的分子遺傳學研究奠定了基礎。
　　 細菌的群體感應系統(quorum sensing,QS)是細菌根據特定的信號分子濃度監(jiān)測環(huán)境變化,并調控相關基因表達來適應環(huán)境變化的一種現象。在枯草芽孢桿菌中,QS系統調控細菌生物膜的形成,抗生素的產成及芽孢的形成等性狀。QS系統包括4個基因,即comX、comQ、comP和comA,其中ComX為10氨基酸肽,經ComQ修飾后分泌到胞外與膜上的組氨酸激酶ComP結合,

4、ComP自磷酸化并將磷酸轉移到ComA,磷酸化的ComA控制感受態(tài)形成等的一系列編碼因子的轉錄。
　　 通過對B.subtilis NCD-2菌株進行全基因組序列分析,從中定位并克隆了OS系統基因comX、comQ、comP和coma。利用同源重組技術對B.subtilis NCD-2菌株中的comQ基因進行了定位突變,獲得comQ基因缺失突變體菌株M6。
　　 提取B.subtilis NCD-2野生型菌株和突變體

5、菌株M6的脂肽提取物。平板拮抗測定結果表明突變體菌株M6的脂肽提取物對番茄灰霉病菌的抑菌效果顯著降低。將脂肽提取物通過基質輔助激光解析質譜(MALDI-TOF-MS)鑒定分析表明:突變體菌株M6較NCD-2野生型菌株脂肽類物質FengycinB的產生量顯著降低；M6比NCD-2多產生一種脂肽類物質IturinB。因此,推測comQ對FengycinB的產生具有正調控作用,對IturinB的產生具有負調控作用。質譜測定同時發(fā)現在NCD-2

6、野生型菌株和突變體菌株M6脂肽提取物中均含有一類分子量較大的未知物質,但其在NCD-2野生型菌株中的濃度顯著高于突變體菌株M6。說明comQ基因對于這組物質的產生有著重要影響。
　　 對NCD-2野生型菌株和突變體菌株M6生物膜的形成進行了定性檢測和定量檢測,結果表明突變體菌株M6的生物膜形成能力明顯下降,推測群體感應系統comQ基因對生物膜的形成具有正調控作用。
　　 本研究為深入了解群體感應系統在NCD-2菌株生防