2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、<p><b>  目 錄</b></p><p>  摘要………………………………………………………………………1</p><p>  關(guān)鍵詞……………………………………………………………………1</p><p>  Abstract………………………………………………………………1</p><p>  

2、Key words…………………………………………………………………1</p><p>  引言…………………………………………………………………………1</p><p>  1 材料與方法………………………………………………………………2</p><p>  1.主要儀器和試劑…………………………………………………………2</p><p>

3、  1.1.1 主要儀器………………………………………………………2</p><p>  1.1.2 主要試劑………………………………………………………2</p><p>  1.1.3 主要試劑的配制………………………………………………3</p><p>  1.2 實(shí)驗(yàn)方法…………………………………………………………3</p><p> 

4、 1.2.1枯草芽孢桿菌的分離…………………………………………3</p><p>  1.2.2染色體DNA的提取……………………………………………4</p><p>  1.2.3分光光度計檢測DNA純度……………………………………4</p><p>  1.2.4 DNA的瓊脂糖凝膠電泳………………………………………5</p><p> 

5、 2 結(jié)果與討論……………………………………………………………………5</p><p>  2.1菌株的鑒定結(jié)果……………………………………………………………5</p><p>  2.2分光光度計法檢測結(jié)果與分析……………………………………………5</p><p>  2.3染色體DNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與分析……………………………5</p>&l

6、t;p>  2.4關(guān)于DNA提取過程的討論……………………………………………6</p><p>  參考文獻(xiàn)………………………………………………………………………7</p><p>  致謝 ……………………………………………………………………7</p><p>  枯草芽孢桿菌染色體DNA的提取</p><p>  生物科學(xué)專業(yè)學(xué)生

7、 </p><p>  指導(dǎo)教師 </p><p>  摘要:從土壤中分離純化并初步鑒定了一株枯草芽孢桿菌,用溶菌酶裂解該菌株,用蛋白酶K和RNase A分別水解去除蛋白質(zhì)和RNA,用分光光度計檢測DNA的純度和濃度,做瓊脂糖凝膠電泳,檢測DNA樣品的質(zhì)量。結(jié)果顯示,從50mL菌液中提取出10μg DNA,并獲得了較完整的瓊脂糖凝膠電泳DNA條帶。<

8、;/p><p>  關(guān)鍵詞:枯草芽孢桿菌, 染色體DNA, 提取, 瓊脂糖凝膠電泳</p><p>  The extraction of chromosomal DNA in Bacillus subtilis</p><p>  Student majoring in Biology Science SongYanhong</p><p>

9、;  Tutor Sun Xun</p><p>  Abstract:Bacillus subtilis was isolated from soil and identified preliminarily .The strain was catalytically dissolved by lysozyme ,and the protein and RNA in the cell

10、 were hydrolytically removed by proteinase K and RNase A, respectively. The results showed that 10μg of chromosomal DNA of bacillus subtilis was extracted out from 50mL of the strain culture by spectrometry , and the DNA

11、 sample was complete through agarose gel electrophoresis .</p><p>  Key words:bacillus subtilis,chromosomal DNA,extraction,agarose gel electrophoresis</p><p><b>  引言 </b></p>

12、<p>  芽孢桿菌是人類發(fā)現(xiàn)最早的細(xì)菌之一。早在1835 年,Ehrenberg 所描述的 Vibrio subtilis即是現(xiàn)在大家熟悉的枯草芽孢桿菌,它是由Cohn 于1872 年正式命名的, 現(xiàn)作為芽孢桿菌科( Bacillaceae) 的模式菌株[1]??莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)是芽孢桿菌屬的一種,從生物學(xué)特性來講, 枯草芽孢桿菌具有典型的芽孢桿菌特征, 其細(xì)胞呈直桿狀。單個細(xì)胞0.7-0.8

13、×2-3微米。著色均勻,無莢膜,周生鞭毛,能運(yùn)動??莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)革蘭氏陽性菌,芽孢0.6-0.9×1.0-1.5微米。橢圓到柱狀,位于菌體中央或稍偏,芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明,微白色或微黃色,在液體培養(yǎng)基中生長時,常形成皺醭??煞纸獾矸?,為典型的好氧菌[2]??衫玫鞍踪|(zhì)、多種糖及淀粉,分解色氨酸形成吲哚。在遺傳學(xué)研究中應(yīng)用廣泛,對此菌的嘌呤核苷酸的合成途徑與其調(diào)節(jié)

14、機(jī)制研究較清楚。廣泛分布在土壤及腐敗的有機(jī)物中,易在枯草浸汁中繁殖,故名。</p><p>  國內(nèi)外關(guān)于枯草芽孢桿菌的研究與應(yīng)用已有100多年的歷史, 早期大部分工作集中在形態(tài)觀察、分類鑒定、生理機(jī)制、功能發(fā)掘及防治等方面。近年來, 對枯草芽孢桿菌研究漸進(jìn)到遺傳學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域, 研究內(nèi)容體現(xiàn)在特定功能基因的尋找并克隆到需要的物種中或者通過誘變、基因工程等手段對枯草芽孢桿菌生產(chǎn)菌進(jìn)行遺傳改造等[3-4]。19

15、97 年, Kunst F.等人首先完成了枯草芽孢桿菌的完整基因組序列測定,并將結(jié)果發(fā)表在Nature雜志上[5]。隨著人們對枯草芽孢桿菌研究的深入開展,發(fā)現(xiàn)其在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、食品保健、水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面具有廣泛應(yīng)用價值[6]。</p><p>  生物的大部分或幾乎全部DNA都集中在細(xì)胞核或核質(zhì)體中。真核細(xì)胞的DNA主要存在于細(xì)胞核中,與蛋白質(zhì)相結(jié)合構(gòu)成大小不一的染色體。從細(xì)菌、植物和哺乳動物細(xì)胞中提取基因

16、組DNA可分兩步:先是溫和裂解細(xì)胞及溶解DNA,接著采用化學(xué)或酶學(xué)的方法,去除蛋白質(zhì)、RNA以及其他的大分子。掌握染色體DNA的提取方法,制備高質(zhì)量的基因組DNA,可用作PCR擴(kuò)增的模板,還可用于構(gòu)建基因文庫以及進(jìn)行DNA印跡(Southern blotting)的材料。</p><p><b>  1 材料與方法</b></p><p>  1.1主要儀器及試劑&l

17、t;/p><p><b>  1.1.1儀器 </b></p><p>  立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠);冰箱(海信北京電器有限公司);紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);恒溫水浴鍋(北京長安科學(xué)儀器廠);高速冷凍離心機(jī)(美國sigma公司);分析天平(上海精天電子儀器有限公司);微波爐(合肥榮事達(dá)三洋電器股份有限公司);電泳儀DYY–II

18、I5型(北京六一儀器廠);水平板電泳槽(北京六一儀器廠);生化培養(yǎng)箱HPS-160(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)公司)、80mL離心管和2mL離心管。</p><p>  1.1.2主要試劑 </p><p>  TE緩沖液、GTE溶液、10%SDS(m/v)、酚/氯仿/異戊醇=25:24:1,氯仿/異戊醇(24:1,體積比)、預(yù)冷的70%乙醇、預(yù)冷的無水乙醇、3mol/L醋酸鈉(pH5.2)、SC

19、溶液、4mol/L NaCl、溶菌酶(50mg/mL,新鮮配制)、1mg/mL溴化乙錠(EB),飽和酚、異丙醇、蛋白酶K(10mg/mL)、RNase A(1mg/mL)、LB液體培養(yǎng)基等。</p><p>  1.1.3主要試劑的配制 </p><p>  1.1.3.1飽和酚溶液[7]</p><p>  取100mL新鮮酚倒入分液漏斗中,加8-羥基喹啉至終濃溶

20、度為0.1%(m/v),溶解混勻,此時溶液呈淡黃色,加入等體積的0.5mol/L Tris-HCl(pH8.0)緩沖液,反復(fù)混勻后,靜止分層,放出下層黃色酚液,棄上層;再加入0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)緩沖液,0.2%的β-巰基乙醇溶液,重復(fù)上一步;直至下層酚相的pH>7.6-7.8;收集下層的黃色酚液,裝于棕色試劑瓶中;加入少量0.1mol/L Tris-HCl (pH8.0)覆蓋在酚液的表面,置4°C冰

21、箱中保存。</p><p>  1.1.3.2 1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)</p><p>  在800mL水中溶解121.91g Tris堿(三羥甲基氨基甲烷,分子量121.14),加入濃鹽酸,調(diào)pH至所需值,加水定容至1L,分裝后高壓滅菌。</p><p>  1.1.3.3 0.5M EDTA(pH8.0) </p><p&

22、gt;  在800mL水中加入186.1g乙二胺四乙酸二鈉(分子量372.2)在磁力攪拌器上劇烈攪拌,用NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0(約20g),然后定容到1L,分裝后高壓滅菌。</p><p>  1.1.3.4 GTE溶液</p><p>  50mmol/L的葡萄糖、25mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)、10mmol/L的EDTA(pH8.0)。</p>&l

23、t;p>  1.1.3.5 LB液體培養(yǎng)基</p><p>  稱取蛋白胨2g,酵母膏1g,NaCl 2g,蒸餾水200mL,用NaOH調(diào)pH7.2,分裝到4個錐形瓶中,121°C滅菌30min。</p><p><b>  1.2實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>  1.2.1 枯草芽孢桿菌的分離</p><

24、;p> ?。?)配制培養(yǎng)基:配制500mL培養(yǎng)基,稱取淀粉10g、硫酸銨1g、磷酸氫二鈉0.5g、酵母粉0.25g、瓊脂10g。稱量好后加去離子水定容到500mL,分裝到兩個錐形瓶中,然后高壓滅菌鍋121°C滅菌30min,倒平板[8]。</p><p> ?。?)配制無菌水200mL,121°C 滅菌30min后備用;另包扎好培養(yǎng)皿,移液管,涂布棒等用品滅菌后,烘干備用。</p&

25、gt;<p> ?。?)制備土壤菌懸液:稱取樣品5g(液體樣品5mL),放入裝有45mL無菌水的三角瓶中,振蕩10min,即為10-1的土壤稀釋液。</p><p> ?。?)取45mL無菌水4瓶,用記號筆編上10-2,10-3,10-4,10-5。</p><p> ?。?)取10-1稀釋液,振蕩后靜止2min,用無菌移液管吸取5mL上層細(xì)胞懸液加至裝有45mL無菌水的試管

26、中,制成10-2稀釋液。同法一次稀釋至各濃度。</p><p> ?。?)另取移液管,分別以無菌操作法吸取10-5,10-4,10-3的稀釋液0.1mL,加至制備好的平板上,用無菌刮刀(涂布棒)涂布均勻。</p><p> ?。?)將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中,于37°C,培養(yǎng)1-2天。</p><p> ?。?)根據(jù)菌落形態(tài)特征,挑取有代表性的單菌落,在相

27、應(yīng)培養(yǎng)基的平板上劃線,直至得到純培養(yǎng)。然后對該菌落進(jìn)行形態(tài)學(xué)以及生理生化反應(yīng)(芽孢染色,革蘭氏染色,淀粉酶水解反應(yīng)觀察透明圈大?。╄b定,確定為枯草芽孢桿菌后,將菌株及時轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上保存。</p><p>  1.2.2染色體DNA的提取</p><p> ?。?)挑取枯草芽孢桿菌菌株的1個菌落于裝有50mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶</p><p>  中,37

28、°C振蕩培養(yǎng)過夜(12-16h)。</p><p> ?。?)吸取1mL的過夜培養(yǎng)物于離心管中,10000r/min,離心1min,收集菌體,棄上清,保留細(xì)胞沉淀。</p><p>  (3)加入100μL GTE溶液,混勻至徹底分散。</p><p> ?。?)再加入500μL GTE溶液,振蕩混勻(注意不要?dú)埩艏?xì)小菌塊)。</p><

29、;p> ?。?)向懸液中加入6μL的50mg/mL溶菌酶至終質(zhì)量濃度為1mg/mL,混勻,</p><p>  37°C溫浴40min。</p><p> ?。?)在向懸液中加入6μL的蛋白酶K至終質(zhì)量濃度為0.1mg/mL,混勻,55°C</p><p>  溫浴1h,中間輕緩顛倒微量離心管數(shù)次。</p><p>

30、 ?。?)溫浴結(jié)束后向溶液中加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(去除蛋白質(zhì)和脂</p><p>  質(zhì)),旋鍋混勻,12000r/min,離心5min,將上清液轉(zhuǎn)移到另一1.5mL的微量離</p><p>  心管中,然后再用酚/氯仿/異戊醇溶液抽提一次。</p><p> ?。?)取上清液用等體積的氯仿/異戊醇溶液抽提一次。</p><p>  

31、(9)取上清液至新的離心管中,向上清液中加入1/10體積的3mol/L醋酸鈉(pH5.2),混勻,加入2倍體積的無水乙醇,上下顛倒混勻,-20°C靜置30min沉淀DNA,取出,4°C,10000r/min,離心10min[9]。</p><p> ?。?0)小心棄去上清液,用1ml預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀,4°C,10000r/min</p><p>  離

32、心5min。自然干燥除去乙醇。 </p><p> ?。?1)用含有RNase A(至終質(zhì)量濃度為20μg/mL)的TE溶解,37°C溫浴40min,</p><p><b>  除去RNA。</b></p><p> ?。?2)將樣品貯存于4°C冰箱中。</p><p>  1.2.3分光光度計檢

33、測DNA純度[10]</p><p>  取30μLDNA樣品,加TE緩沖液至3mL,轉(zhuǎn)入分光光度計的石英比色杯中;</p><p>  然后分光光度計也用TE緩沖液校正零點(diǎn);在260nm和280nm分別讀出光密度值,</p><p>  依據(jù)OD260, OD280以及OD260/OD280的比值檢測制備的總DNA樣品的濃度和純</p><p&

34、gt;<b>  度。 </b></p><p>  1.2.4 DNA的瓊脂糖凝膠電泳</p><p> ?。?)制膠:稱取0.4g瓊脂糖,加入50mL 1×TAE緩沖液微波爐加熱,冷卻</p><p>  至60°C時倒膠,凝膠凝固后,取出梳子,放入電泳槽中,并加入電泳緩沖液。</p><p> 

35、?。?)上樣:取10μL,20μL,30μL DNA樣品與上樣緩沖液混合,用移液槍將DNA樣品加入樣品孔中。</p><p> ?。?)電泳:接通電源,當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動到適當(dāng)位置處,停止電泳。</p><p> ?。?)剝膠染色:將剝下的凝膠浸入溴化乙錠(EB,0.5μg/mL)染色液中,室溫染色30min。然后在凝膠成像儀上觀察并拍照。</p><p><b

36、>  2 結(jié)果與討論</b></p><p>  2.1菌株的鑒定結(jié)果</p><p>  菌落呈白色,邊緣不規(guī)則,表面粗糙褶皺,不透明,黏稠?xiàng)U狀,產(chǎn)芽孢,長</p><p>  桿形;芽孢染色后,用油鏡可觀察到芽孢被染成綠色,菌體呈紅色;革蘭氏染色</p><p>  顯微鏡下觀察到菌體呈藍(lán)紫色,為陽性菌;淀粉酶水解反應(yīng)

37、時可觀察到明顯的水</p><p>  解圈。經(jīng)過分離,純化和初步鑒定,獲得一株枯草芽孢桿菌,用于其染色體DNA</p><p><b>  的提取。</b></p><p>  2.2.分光光度計法檢測結(jié)果與分析</p><p>  本論文用分光光度法檢測所提枯草芽孢桿菌染色體DNA樣品的濃度和純度,結(jié)果見表1。<

38、;/p><p>  表1分光光度計測定結(jié)果</p><p>  從表1中可以看出,樣品DNA的OD260/OD280的比值在1.6-1.7之間,說明樣品DNA的濃度純度基本達(dá)到要求,但是此比值小于1.8,說明樣品中可能仍存在少許蛋白質(zhì)或酚,這些雜質(zhì)可能是導(dǎo)致比值偏低的原因。</p><p>  2.3染色體DNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與分析 </p><

39、;p>  瓊脂糖凝膠電泳可用于檢測所提DNA樣品的質(zhì)量和大小,結(jié)果見圖1。</p><p>  1 2 3 Marker</p><p>  圖1染色體DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖譜</p><p>  從圖1中可以看出,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,樣品DNA條帶沒有出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象,說明所提DNA樣品具有較好的完整性,可用做今后構(gòu)建其基因文庫的材料。</p>

40、<p>  2.4關(guān)于DNA提取過程的討論</p><p>  本實(shí)驗(yàn)從枯草芽孢桿菌中提取染色體DNA,根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書的提</p><p>  取方法,對枯草芽孢桿菌染色體DNA進(jìn)行了提取,先用溶菌酶對枯草芽孢桿菌進(jìn)</p><p>  行裂解,溶菌酶的處理是關(guān)鍵,在溫浴中可以振蕩混勻2~3次,如果細(xì)菌懸濁液變清,表明溶菌酶處理效果較好,否則

41、需要補(bǔ)加溶菌酶,適當(dāng)延長溫浴時間;然后用酚、氯仿/異戊醇進(jìn)行抽提(去除蛋白質(zhì),脂類等大分子物質(zhì)),再加入醋酸鈉、異丙醇沉淀DNA;最后加入含有RNase A酶的TE緩沖液進(jìn)行多次沉淀洗滌,以充分溶解附在管壁上的總DNA,用加入的TE緩沖液多次、反復(fù)地洗滌DNA沉淀所在部位時,操作要輕柔,以免快速吹吸導(dǎo)致剪切力過大使DNA斷裂。將經(jīng)此方法提取出來的DNA用分光光度計測260nm和280nm處的光吸收值,并計算OD260/OD280的比值,

42、若OD260/OD280的比值大于1.8,說明仍存在RNA,則考慮用RNA酶處理樣品;若小于1.6,說明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚,應(yīng)再用酚、氯仿抽提,以乙醇沉淀純化DNA。多次測量發(fā)現(xiàn)此比值均小于1.6,說明提取的DNA中可能仍含有大量的蛋白質(zhì)。原因可能是在DNA提取過程中操作時間長,導(dǎo)致某些試劑的pH及性質(zhì)發(fā)生了變化,而且純化步驟少,所以未能達(dá)到理想的純化效果,提取的DNA純度不符合要求。</p><p>  在進(jìn)

43、行第二次提取之前,將所有試劑都進(jìn)行重新配制,并重調(diào)pH,加入溶菌酶后并延長溫浴時間,更好的裂解枯草芽孢桿菌;為了將蛋白質(zhì)去除干凈,加入了蛋白酶K,并增加了飽和酚的抽提次數(shù)。在沉淀DNA時,將醋酸鈉溶液,無水乙醇,70%乙醇放入-20°C冰箱中預(yù)冷,并將DNA放入-20°C冰箱30min,增強(qiáng)DNA沉淀效果。然后將取出來的DNA用分光光度計測260nm和280nm處的光吸收值,并計算OD260/OD280的比值,多次測

44、量此比值均大于1.6,說明DNA樣品中蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)已基本除盡,所提取DNA的純度符合要求。</p><p><b>  參考文獻(xiàn)</b></p><p>  [1] 劉志恒. 現(xiàn)代微生物學(xué)[M]. 北京:科學(xué)出版社, 2002.p92-99.</p><p>  [2] 東秀珠, 蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京:科學(xué)出版社,

45、2001.</p><p>  [3] 王紅革.地衣芽孢桿菌淀粉酶基因在枯草芽孢桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)[J].微生物</p><p>  學(xué)報,1997.37(2):101-106.</p><p>  [4] 馮清平,薛林貴.復(fù)合誘變原生質(zhì)體選育耐熱堿菌[J].微生物學(xué) 報,1996.36(6):30-32.</p><

46、p>  [5] KUNST F, OGASAWARA N, MOSZER L, et al. The complete genome sequence </p><p>  Of the Gram positive bacterium Bacillus subtilis[J]. Nature,1997, 390: 249-256.</p><p>  [6] 惠明,竇麗娜. 枯草芽孢

47、桿菌的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)報,2008,36(27): 623-624.</p><p>  [7] 盧圣棟.現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(第二版)[M].中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,1999.p66-67.</p><p>  [8] 沈萍, 陳向東. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程第四版[M].高等教育出版社, 2007.p151-152.</p&

48、gt;<p>  [9] 朱旭芬. 基因工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)第二版[M]. 高等教育出版社,2010.p28-31.</p><p>  [10] . 環(huán)狀芽孢桿菌的分離鑒定和分子生物學(xué)特性的初步研究. 四川大學(xué)碩士論文, 1992.p8-9.</p><p><b>  致謝</b></p><p>  本畢業(yè)論文實(shí)驗(yàn)工作是在菏

49、澤學(xué)院生命科學(xué)系 教授悉心指導(dǎo)和嚴(yán)格要求下完成的。孫老師嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度、執(zhí)著的科研精神、淵博的專業(yè)知識給我以深刻的教誨和指導(dǎo),讓我受益匪淺。他為我們提供了很多相關(guān)的實(shí)驗(yàn)資料,同時也幫助我們解決了很多在實(shí)驗(yàn)中遇到的難題。在他的指導(dǎo)下,使我在鞏固自己的專業(yè)知識的同時也意識到了自己的不足。在論文完成之際,向敬愛的孫老師致以最衷心的感謝!</p><p>  實(shí)驗(yàn)期間和同實(shí)驗(yàn)室的同學(xué)共同度過,大家相互幫助,相互關(guān)心

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