水稻組織特異表達(dá)啟動(dòng)子的分離克隆、功能分析及應(yīng)用.pdf

1、高等植物的生長(zhǎng)發(fā)育是不同基因在時(shí)間和空間上有序表達(dá)和協(xié)同作用的過(guò)程。啟動(dòng)子作為轉(zhuǎn)錄水平上一個(gè)重要的調(diào)控元件，通過(guò)和眾多轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合進(jìn)而決定了基因的表達(dá)模式與表達(dá)強(qiáng)度。深入研究啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)、功能、作用模式等對(duì)于回答分子生物學(xué)中的一些基本理論問(wèn)題具有重大意義。如何讓外源基因在植物體內(nèi)定向、高效、穩(wěn)定的表達(dá)是植物基因工程研究的出發(fā)點(diǎn)和落腳點(diǎn)。用組織特異表達(dá)啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)可有效的避免用組成型表達(dá)啟動(dòng)子所帶來(lái)的一些諸如代謝負(fù)擔(dān)之類的負(fù)

2、面效應(yīng)。但是目前調(diào)控機(jī)理清楚且可用于作物遺傳改良的組織特異表達(dá)啟動(dòng)子仍然較少。
　　 水稻是非常重要的糧食作物之一，亦是功能基因組學(xué)研究的模式植物。本研究的目的就是從水稻中分離克隆組織器官特異表達(dá)啟動(dòng)子，分離鑒定起關(guān)鍵調(diào)控作用的順式元件，為轉(zhuǎn)基因水稻育種服務(wù)，為長(zhǎng)遠(yuǎn)的啟動(dòng)子改造和設(shè)計(jì)儲(chǔ)備資源。本研究獲得的主要結(jié)果如下：
　　 1.構(gòu)建改造5個(gè)專門用于水稻啟動(dòng)子克隆及功能驗(yàn)證的載體：DX2181、DX2181S、DX218

3、1G、DX2181Smini46和DX2181Smini89。
　　 2.利用RT-PCR的辦法對(duì)基于芯片數(shù)據(jù)挑選出的胚乳特異表達(dá)候選基因En2做進(jìn)一步表達(dá)模式鑒定。分離克隆En2的啟動(dòng)子EnP2，將其與報(bào)告基因GUS融合，轉(zhuǎn)基因結(jié)果證明EnP2為胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子。5’系列缺失證明，155bp的長(zhǎng)度的啟動(dòng)子(EnP2-155)就足以維持胚乳特異表達(dá)模式。
　　 3.利用RT-PCR的辦法對(duì)基于芯片數(shù)據(jù)挑選出的胚乳特異表

4、達(dá)候選基因En3做進(jìn)一步表達(dá)模式鑒定。分離克隆En3的啟動(dòng)子EnP3，轉(zhuǎn)基因結(jié)果證明EnP3為胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子。5’系列缺失證明，126bp長(zhǎng)度的區(qū)域(從啟動(dòng)子EnP3-292到EnP3-166之間的區(qū)域)對(duì)于維持EnP3-292胚乳特異表達(dá)模式是至關(guān)重要的。突變分析發(fā)現(xiàn)順式作用元件“2SSEEDPROTBANAPA”和“GCN4-like motif”以負(fù)向調(diào)控元件身份來(lái)對(duì)EnP3-292胚乳特異表達(dá)模式進(jìn)行調(diào)控，但并不影響啟動(dòng)子在

5、胚乳中的表達(dá)模式與強(qiáng)度。
　　 4.利用RT-PCR的辦法對(duì)基于芯片數(shù)據(jù)挑選出的綠色組織特異表達(dá)候選基因DX1做進(jìn)一步表達(dá)模式鑒定。分離克隆DX1的啟動(dòng)子PDX1，轉(zhuǎn)基因結(jié)果證明PDX1為綠色組織特異表達(dá)啟動(dòng)子。5’及3’系列缺失證明-195至-22和+1至+86這兩個(gè)區(qū)域直接決定啟動(dòng)子PDX1的活性，凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)在這兩個(gè)區(qū)域分別鑒定出綠色組織特異表達(dá)順式作用元件GSE1和GSE2。突變分析發(fā)現(xiàn)GSE1和GSE2都是作為正向調(diào)控

6、元件來(lái)的行使功能的，GSE1可以同時(shí)調(diào)控所有綠色組織(葉片、葉鞘、莖桿和穗)基因的表達(dá)且影響作用較大，而GSE2只能調(diào)控葉鞘和莖桿這兩個(gè)組織基因的表達(dá)且影響作用較微弱。
　　 5.用根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法，將粳稻品種“日本晴”來(lái)源的rbcS基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的cryl C*基因?qū)刖酒贩N中花11，結(jié)合Southern blolting檢測(cè)、純合陽(yáng)性株系篩選、田間抗性評(píng)價(jià)、農(nóng)藝性狀考察及CrylC*蛋白測(cè)定，最終從47