小麥花粉特異性啟動(dòng)子的分離和功能分析.pdf

1、小麥?zhǔn)鞘澜缟现匾募Z食作物之一，為全球35%以上的人口提供每日所需的蛋白質(zhì)和熱量，是我國(guó)的第二大糧食作物。分離和分析小麥花藥/花粉的特異性表達(dá)基因和啟動(dòng)子有助于深入了解小麥有性生殖過程中的基因表達(dá)調(diào)控，亦可用于雄性不育系的創(chuàng)建，避免水平基因轉(zhuǎn)移帶來的生物安全問題，具有重要的理論意義和實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值。但小麥花藥/花粉發(fā)育的研究卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于其他作物，如水稻、玉米等。除了少數(shù)幾例小麥花藥/花粉特異性基因的研究報(bào)道外，至今還未見有關(guān)小麥花藥/花粉

2、特異性啟動(dòng)子的相關(guān)報(bào)道。本論文對(duì)小麥花粉特異性基因TaPSG719的啟動(dòng)子進(jìn)行了分離分析工作，具體研究結(jié)果如下：
　　 (1)根據(jù)文獻(xiàn)中已發(fā)表的TaPSG719基因的mRNA序列，獲得了該基因1024 bp的DNA序列，經(jīng)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)該基因編碼區(qū)域無內(nèi)含子，且堿基序列完全相同。在獲得TaPSG719基因部分DNA序列的基礎(chǔ)上，采用反向PCR技術(shù)，獲得了該基因起始密碼子上游1,776 bp的啟動(dòng)子序列。用PLACE和PlantCAR

3、E數(shù)據(jù)庫對(duì)分離的序列進(jìn)行元件分析后發(fā)現(xiàn)，該序列除含有TATA-box、CAAT-box等啟動(dòng)子具有的一般元件外，還含有與花粉特異性表達(dá)相關(guān)的元件：AGAAA元件（10個(gè)）和GTGA元件（8個(gè)），推測(cè)其可能是花粉特異性啟動(dòng)子。
　　 (2)為了驗(yàn)證TaPSG719啟動(dòng)子的調(diào)控特性，構(gòu)建了含1.0 kb 啟動(dòng)子序列的p1.0GUS載體，以及含1.7 kb該啟動(dòng)子序列的p1.7GFP和p1.7GUS載體。通過基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)，將p1.7

4、GFP載體轉(zhuǎn)化小麥Bobwhite幼胚，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)GFP熒光檢測(cè)，證明TaPSG719啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)GFP基因在小麥的花粉中表達(dá)。采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)，將p1.7GUS和p1.0GUS載體轉(zhuǎn)化煙草，獲得了轉(zhuǎn)基因煙草植株。經(jīng)GUS組織化學(xué)檢測(cè)和GUS熒光定量分析，證實(shí)TaPSG719啟動(dòng)子不具有TaPSG719基因的種屬特異性，其在小麥種屬外的煙草中也有組織特異性啟動(dòng)活性，可驅(qū)動(dòng)基因在花粉發(fā)育中期開始表達(dá)直至花粉發(fā)育成熟。而且1.0