CaMKⅡα基因在猴腦不同區(qū)域的特異性表達及其啟動子分析.pdf

1、多功能的鈣離子/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)參與細胞內(nèi)鈣離子信號向下游多種通路的傳遞。CaMKⅡ可通過自身結(jié)構(gòu)上的一段可變區(qū)的不同剪切產(chǎn)生不同的異構(gòu)體的現(xiàn)象被認為與不同的功能實現(xiàn)有關(guān)。CaMKⅡalpha亞型(CaMKⅡα)是在大鼠腦中特異并且大量表達的一種CaMKⅡ亞型，在學習和記憶機制中起著重要作用。為了分析CaMKⅡα在猴腦中的表達情況，我們運用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法克隆了猴腦中存在的CaMKⅡαcDNA全編碼序

2、列。我們得到了五種CaMKⅡα異構(gòu)體，其中包括兩種在大鼠、人類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并研究的α、αB和另外三種新的異構(gòu)體α3、α3B和α4。其中，α3、α3B均在α、αB基礎(chǔ)上在結(jié)合區(qū)的可變區(qū)的C端又缺失了兩個共171bp的外顯子，而α4在α基礎(chǔ)上在可變區(qū)的C端缺失了一個76bp的外顯子。通過跨可變區(qū)設(shè)計特異性引物，在mRNA水平上的檢測顯示，這些新的異構(gòu)體僅存在于猴腦中，而狗和大鼠腦中均不存在。我們分離了猴腦前腦皮層、海馬、丘腦、上下丘和小腦各區(qū)

3、，通過設(shè)計CaMKⅡα特異性引物和運用CaMKⅡα特異性抗體分別進行RT-PCR和westernblot分析發(fā)現(xiàn)在mRNA水平，前腦皮層表達量最高，而在蛋白水平，丘腦中CaMKⅡα蛋白含量最高。結(jié)果揭示在猴腦中CaMKⅡα基因的表達也具有腦區(qū)特異性，同時也說明在間腦和中腦中特異表達的αB的蛋白更穩(wěn)定。 大鼠CaMKⅡα基因的啟動子含有一個必須的TATA元件，細胞水平的功能測試顯示該啟動子在神經(jīng)細胞中的活性遠遠高于在非神經(jīng)細胞中的

4、活性。為了分析人的CaMKⅡα基因啟動子，我們建立了基于不同細胞株的啟動子-報告基因測試系統(tǒng)。我們從人的基因組DNA中克隆出一段2047bp的人CaMKⅡα基因啟動子。DNA序列分析顯示，人CaMKⅡα基因啟動子不含TATA元件。我們構(gòu)建了一系列5’側(cè)翼或3’側(cè)翼缺失的啟動子片段和熒光素酶報告基因相連的的重組質(zhì)粒，并用來轉(zhuǎn)染人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y和大鼠嗜鉻神經(jīng)瘤細胞PC12兩種神經(jīng)細胞株，及人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251和人胚胎腎細

5、胞HEK293兩種非神經(jīng)細胞株。報告基因測試結(jié)果顯示人CaMKⅡα基因啟動子在神經(jīng)細胞中活性高于在非神經(jīng)細胞中的活性。同時維甲酸(All-transretinoicacid，簡稱RA)可以增強啟動子在SH-SY5Y細胞中的活性。進一步分析顯示在啟動子的+11to+136和-1911to-593區(qū)分別存在RA響應(yīng)元件。另外，在啟動子的-179to-244區(qū)還發(fā)現(xiàn)一個較強的沉默元件。本研究為揭示CaMKⅡα基因在非人靈長類和人腦中的特異表達