枳根特異性contig2基因及啟動(dòng)子的克隆與分析.pdf

1、柑橘是世界上最重要的果樹(shù)之一。砧木是果樹(shù)的基礎(chǔ),砧木的根系是影響接穗對(duì)營(yíng)養(yǎng)、水分和無(wú)機(jī)鹽吸收的關(guān)鍵功能器官,同時(shí),也是直接對(duì)抗土壤微生物、干旱、酸性和重金屬侵害的第一道防御系統(tǒng),因此,根對(duì)于植物的生長(zhǎng)發(fā)育及其產(chǎn)量具有重要的生物學(xué)意義。目前,在擬南芥等模式植物中,根生長(zhǎng)發(fā)育及代謝相關(guān)基因的研究已取得了較大進(jìn)展,許多根特異表達(dá)的功能基因和調(diào)控序列已進(jìn)行克隆和分析;而在柑橘中,相關(guān)研究報(bào)道很少。因此,開(kāi)展柑橘根特異表達(dá)基因和調(diào)控序列的克隆和分

2、析對(duì)促進(jìn)柑橘等果樹(shù)品種根部相關(guān)性狀的基因工程定向改良工作具有重要的研究?jī)r(jià)值,也是柑橘基因工程育種的熱點(diǎn)方向之一。
　　 枳(Poncirustrifoliata)是我國(guó)主導(dǎo)砧木品種。本研究在枳根差減cDNA文庫(kù)中篩選出的unigenessingleton297和contig22與枳根全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)中的contig2完全匹配,利用生物信息學(xué)、分子生物學(xué)及轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)contig2進(jìn)行了基因和啟動(dòng)子的克隆及表達(dá)分析,主要結(jié)果如下:

3、
　　 1、contig2組織表達(dá)分析
　　 contig2與CitrusFunctionalGenomicsProject(CFGP)中登錄的23個(gè)EST具有高度序列同源性,這23個(gè)EST序列大多來(lái)源于柑橘根cDNA文庫(kù)。
　　 以枳1月齡苗、6月齡苗、20年生成年樹(shù)的根和葉組織為材料,運(yùn)用Real-TimePCR技術(shù)對(duì)contig2進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析,結(jié)果表明contig2在根中的表達(dá)量分別是葉中的的46.3

4、4、74.82、110.25倍,進(jìn)一步說(shuō)明contig2具有根特異性表達(dá)。
　　 2、contig2基因特征
　　 contig2核苷酸序列全長(zhǎng)801bp,含1個(gè)內(nèi)含子(104bp)和2個(gè)外顯子。其開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)471bp,3'端非翻譯區(qū)含加尾信號(hào)AATAAA。
　　 3、contig2編碼蛋白特征
　　 contig2編碼主要乳膠蛋白(majorlatexprotein,MLP),含bet_v_I功能域,

5、由156個(gè)氨基酸組成,分子量為17.63kDa,等電點(diǎn)為5.49。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)含3個(gè)α-螺旋和5個(gè)β-折疊,包含有的一個(gè)保守疏水基結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)富含甘氨酸的回環(huán)結(jié)構(gòu)。
　　 4、contig2啟動(dòng)子的克隆與分析
　　 通過(guò)1次同源克隆和2次YADE-PCR,獲得contig2的5'端上游1685bp調(diào)控序列。并運(yùn)用PlantCARE軟件對(duì)該序列進(jìn)行啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)分析,在序列中發(fā)現(xiàn)有TATA-box、CAAT-box等一般啟動(dòng)

6、子結(jié)構(gòu)的核心元件,還具有CCAAT、as-2-box、CAT-box、MBS、TGACG-motif等特異性應(yīng)答元件。
　　 5、contig2啟動(dòng)子表達(dá)特異性分析
　　 以pBI121載體為骨架構(gòu)建了含有contig2啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體pBI121-2P,利用農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化枳上胚軸,抗性芽長(zhǎng)出后進(jìn)行生根培養(yǎng),共獲得21株轉(zhuǎn)基因苗。GUS染色結(jié)果表明在轉(zhuǎn)基因植株根比葉顯色深。選取5株轉(zhuǎn)基因苗進(jìn)行Real-TimePCR,