前列腺特異性抗原啟動子-增強子重組質(zhì)粒篩選及特異性的體外鑒定.pdf

1、目的:利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)從人類基因組DNA中分別擴增PSA啟動子(prostate-specific antigen promoter, PSAP)和增強子(prostate-specific antigen enhancer, PSAE)片段,將擴增的PSA啟動子/增強子片段分別克隆入熒光素酶報告基因載體pTAL-Luc,并構(gòu)建三組含不同調(diào)控序列的重組質(zhì)粒PSAP1-Luc,PSAP2-Luc以及PSAE-Luc,將重組

2、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入三株不同癌細胞后分別定量檢測熒光素酶基因表達情況,以優(yōu)選具有最強調(diào)控基因表達活性的啟動子/增強子片段并驗證其組織特異性。
　　方法:參照美國NCBI Nucleotide獲得的序列(U37672.1),利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計PSA啟動子和增強子的擴增引物;采用PCR技術(shù)分別擴增三個PSA啟動子/增強子片段,將擴增出的PSA啟動子/增強子片段通過酶切反應(yīng)分別與熒光素酶報告基因載體 pTAL-Luc連

3、接得到三組重組質(zhì)粒。將三組重組質(zhì)粒分別和內(nèi)參照β-半乳糖甘酶共轉(zhuǎn)染入三株癌細胞,前列腺癌細胞(PC-3)、宮頸癌細胞(Hela)和乳腺癌細胞(MCF-7)中,每組重復(fù)三次。利用生物化學(xué)發(fā)光儀及多功能酶標(biāo)儀分別定量測出熒光素酶活性數(shù)值(L值)與β-半乳糖甘酶吸光度值(G值),并計算出兩者之間的比值即L/G值,所得的L/G值反映三組重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染三株不同癌細胞中的熒光素酶基因表達情況,從而篩選出調(diào)控外源基因表達最強的PSA啟動子/增強子序列并

4、同時進行組織特異性的驗證。
　　結(jié)果:利用設(shè)計好的三對PSA啟動子/增強子引物經(jīng)PCR技術(shù)成功擴增出PSAP1片段(537 bp),PSAP2片段(620 bp)和PSAE片段(1.4 kb);將三個目的基因片段克隆入熒光素酶報告基因載體pTAL-Luc,成功構(gòu)建出三組重組質(zhì)粒PSAP1-Luc, PSAP2-Luc和 PSAE-Luc;三組重組質(zhì)粒分別與內(nèi)參照β-半乳糖甘酶共轉(zhuǎn)染入三株癌細胞結(jié)果顯示:前列腺癌細胞(PC-3)中所

5、測得的熒光素酶數(shù)值與β-半乳糖苷酶的比值(L/G值)最大,比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);PSAP2-Luc在三組重組質(zhì)粒中測得的熒光素酶數(shù)值與β-半乳糖苷酶的比值最大,比較差異有顯著性意義(P<0.01)。
　　結(jié)論:對三組重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入三株不同癌細胞的熒光素酶活性評價:前列腺癌細胞(PC-3)中表達的熒光素酶活性高于宮頸癌細胞(Hela)和乳腺癌細胞(MCF-7),表明PSA啟動子/增強子調(diào)控基因表達具有前列腺組織特異性

6、;PSA啟動子和增強子均可調(diào)控?zé)晒馑孛富虮磉_,而以包含620 bp長度的PSAP2啟動子調(diào)控的熒光酶基因表達活性最強,其為本實驗篩選出的最優(yōu)長度的PSA啟動子序列;篩選出的最優(yōu)長度PSA啟動子將為開展多模態(tài)成像監(jiān)測組織特異性PSA啟動子調(diào)控表達基因編輯工具--轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)剪切雄激素受體治療前列腺癌的可行性研究