雞輸卵管特異性表達(dá)啟動子的迷你化研究.pdf

1、用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥用蛋白已取得突破性進展，具有廣闊的應(yīng)用前景。與哺乳動物的乳腺生物反應(yīng)器相比，家禽輸卵管作為生物反應(yīng)器則具有個體小，產(chǎn)蛋量高，世代間隔小，易于規(guī)?；a(chǎn)，禽蛋中蛋白含量相對較高等優(yōu)勢。但是基于禽類自身的生殖生理特點，雞輸卵管生物反應(yīng)器的研究相對滯后，外源蛋白在輸卵管中缺乏獲得特異、高效率的表達(dá)調(diào)控手段。近幾年，轉(zhuǎn)基因家禽的制備在國內(nèi)外多個研究機構(gòu)取得了成功，如何使轉(zhuǎn)基因家禽高效率的生產(chǎn)重組蛋白，已成為決定家禽生物反應(yīng)器能

2、否進入應(yīng)用領(lǐng)域的關(guān)鍵。本實驗擬篩選高效調(diào)控卵清蛋白基因表達(dá)的元件，并將其整合制備人工優(yōu)化啟動子，將能有效提高卵清蛋白的生產(chǎn)效率。本研究根據(jù)實驗室已有結(jié)果，選取雞輸卵管卵清蛋白基因上游調(diào)控序列和第一內(nèi)含子作為研究對象，對其進行表達(dá)載體構(gòu)建和優(yōu)化研究。本研究從以下幾方面開展:
　　1、雞卵清蛋白基因上游調(diào)控序列表達(dá)載體的構(gòu)建
　　根據(jù)實驗室已有結(jié)果對雞卵清蛋白基因上游調(diào)控序列進行分析得出，-921～+38區(qū)域具有較高的表達(dá)活性，

3、但失去了組織特異性，上游2.1kb具有較高的轉(zhuǎn)錄活性和組織特異性，3.1kb區(qū)域則具有更嚴(yán)密的組織特異性，長于3.1kb表達(dá)活性顯著降低。根據(jù)分析結(jié)果，將-922～-2073和-2801～-3100區(qū)域平均分成12個長度約為150bp的序列，分別插入到-921～+38序列的上游，構(gòu)建成熒光素酶基因報告載體。測序結(jié)果顯示，成功構(gòu)建12個系列表達(dá)載體，為進一步篩選短縮版優(yōu)化啟動子提供材料。
　　2、迷你內(nèi)含子變異報告載體的制備

4、　　PCR擴增卵清蛋白基因-1338～+1640片段(A:Intron-contain)和-1338～+38片段(B:Intron-less)，插入至熒光素酶報告載體，命名為pGL4-intron-contain、pGL4-intron-less;設(shè)計在A載體基礎(chǔ)上去除第一內(nèi)含子，僅保留供體位點和受體位點的熒光素酶報告載體（C:Inron-delation），命名為pGL4-合成;然后在C載體中插入一級迷你內(nèi)含子(約300bp)片段，分

5、別命名為pGL4-mini intron-1、pGL4-mini intron-2、pGL4-mini intron-3、pGL4-mini intron-4、pGL4-mini intron-5，制備成含一級迷你內(nèi)含子的的多種變異報告載體。測序表明，成功構(gòu)建上述載體，為篩選優(yōu)化的迷你內(nèi)含子提供必要的材料。
　　3、雞原代輸卵管上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立。
　　以初開產(chǎn)的母雞作為材料，通過輸卵管組織分離、胰蛋白酶消化、細(xì)胞純化、

6、轉(zhuǎn)染前培養(yǎng)等技術(shù)環(huán)節(jié)的摸索，獲得了原代雞輸卵管上皮細(xì)胞，為檢測卵清蛋白基因啟動子的組織特異性表達(dá)提供了試驗平臺。
　　4、卵清蛋白啟動子片段的表達(dá)活性及特異性檢測。
　　將二十種啟動子-報告基因重組載體轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞進行了螢光素酶活性的檢測，找出具有最強活性重組質(zhì)粒pGL4-UP-1412和內(nèi)含子重組質(zhì)粒pGL4-mini-intron-3;同時推斷出若干包含增強子序列區(qū)域。二十種啟動子-報告基因重組載體在輸卵管上皮細(xì)胞上