內(nèi)皮細胞特異性表達啟動子的克隆.pdf

1、血友病A是由于凝血因子Ⅷ(hFⅧ)的功能缺陷導(dǎo)致的一種單基因遺傳病。該遺傳病的基因治療策略一般是通過基因?qū)氲姆绞绞共∪思毎軌虮磉_正常的FⅧ。在這個過程中，組成型啟動子(constitutive promoter)常常用來啟動FⅧ的表達。但是在以往的研究中我們發(fā)現(xiàn)，組成型啟動子在某些特定的細胞類型中并不能夠有效地啟動下游結(jié)構(gòu)基因的表達。
　　 組織特異啟動子(tissue-specific promoter)，不同于組成型啟動

2、子。在這類啟動子調(diào)控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達，并表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性，因此也有著一些不可替代的優(yōu)勢。由于在正常機體內(nèi)，F(xiàn)Ⅷ特異性表達于內(nèi)皮細胞，因此我們試圖克隆內(nèi)皮細胞特異性表達啟動子，并建立含有內(nèi)皮細胞特異啟動子啟動報告基因表達的人胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)系，用于后續(xù)hESCs向內(nèi)皮細胞分化及血友病A基因治療的研究。
　　 目的:構(gòu)建并驗證含有內(nèi)皮細胞特

3、異性表達報告基因的質(zhì)粒。
　　 方法:1.建立從外周血、臍血、臍靜脈中分離和培養(yǎng)內(nèi)皮細胞的方法;2.構(gòu)建GFP內(nèi)皮細胞特異表達質(zhì)粒。分別PCR擴增內(nèi)皮細胞特異性表達基因vWF、VE-cadherin(CD144)轉(zhuǎn)錄起始位點上游啟動子片段。用pEGFP-N1載體為骨架，以內(nèi)皮細胞特異性表達基因的啟動子完全取代CMV啟動子，構(gòu)建4個質(zhì)粒:pvWF-1、pvWF-2、pVE-1、 pVE-2;3.用這些質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染新分離的原代內(nèi)皮細

4、胞、Huvec細胞系、hESCs證明其表達的特異性。
　　 結(jié)果:1.分別從外周血、臍血、臍靜脈中分離得到可以在體外培養(yǎng)的具有內(nèi)皮細胞特異性的細胞，建立穩(wěn)定獲取內(nèi)皮細胞的方法;2.所構(gòu)建的載體pvWF-1、pvWF-2、pVE-1、pVE-2經(jīng)酶切鑒定，所獲得酶切片段的大小與預(yù)期值相符;3.所構(gòu)建的載體pvWF-1、pvWF-2、pVE-1、pVE-2測序結(jié)果與預(yù)期序列相符;4.構(gòu)建好的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染新分離的原代內(nèi)皮細胞、Huve