棉纖維特異表達基因及啟動子的克隆.pdf

1、中國雖然是世界最大的棉花生產(chǎn)國和消費國，但在棉花纖維的內(nèi)在品質(zhì)方面卻與美國等其它一些產(chǎn)棉國存在很大差距，因此，培育品質(zhì)優(yōu)良的棉花是當前棉花育種的一項緊迫的任務(wù)，但由于棉花纖維品質(zhì)與產(chǎn)量之間的遺傳負相關(guān)性，給用傳統(tǒng)育種技術(shù)同步改良纖維品質(zhì)與產(chǎn)量帶來了很大的障礙，纖維品質(zhì)改良進展緩慢。 基因工程作為棉纖維品質(zhì)改良的一個新的研究領(lǐng)域，有兩條途徑，一是分離鑒定出與纖維品質(zhì)相關(guān)的基因，深入了解棉纖維發(fā)育的分子機制，通過增加和減少這些與棉纖

2、維品質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)或酶的表達水平，來達到改良纖維品質(zhì)的目的，另一途徑是從其它生物中選擇有潛力的目的基因，將其導(dǎo)入棉花，以提高纖維品質(zhì)。組成型啟動子CaMV35S雖然能驅(qū)動外源基因的穩(wěn)定表達，但其在整個植株中的表達消耗了棉花體內(nèi)大量的基礎(chǔ)物質(zhì)，也影響了植物的生長發(fā)育。因此，克隆在棉纖維中特異表達的啟動子將為遺傳工程改良棉纖維提供有效的工具，在品質(zhì)改良中具有重要的實際意義。 本研究以陸地棉蘇12為試材，對葉片和纖維進行差減雜交，得到

3、10條在棉纖維中差異表達的片斷并克隆得到其中一條GhTIP的基因全長及其部分啟動子序列，研究結(jié)果如下： (1)優(yōu)化了棉花mRNA差異顯示體系，利用改良的CTAB法分別提取棉花葉片和纖維的總RNA，并對影響mRNA差異顯示的三個關(guān)鍵因素：引物濃度、dNTP濃度和Mg2+濃度進行調(diào)整，得到適合比較棉花纖維和葉片的差減體系。 (2)通過mRNA差異顯示技術(shù)，共獲得24個差異條帶。經(jīng)過反向斑點雜交的篩選，得到10條棉纖維特異表達

4、片段，通過NCBI的Blastx和Blastn，對他們進行了初步分析。 (3)在差異片段序列的基礎(chǔ)上，應(yīng)用SMART法獲得了其中一條差異片段CYG11的全長cDNA，Blastn分析發(fā)現(xiàn)它是編碼酪氨酸激酶相互作用蛋白γ-亞基的基因GhTIP，通過與DNA序列比對，發(fā)現(xiàn)它含有兩段內(nèi)含子區(qū)。 (4)經(jīng)染色體步移技術(shù)得到GhTIP基因部分5'端上游序列，經(jīng)PlantCARE分析結(jié)果表明：此序列中含有TATA-box、CAAT-