Lrrc10基因啟動子的克隆.pdf

1、目的：小鼠心臟特異性表達(dá)基因LrrclO，在細(xì)胞中可能涉及了廣泛的信號調(diào)控過程。本研究旨在通過構(gòu)建以Lrrcl0啟動子及其兩個截短啟動子介導(dǎo)的LUC報告基因載體，比較不同啟動子片段在不同細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的差異，確定不同啟動子片段的啟動子活性和具有啟動子活性的的序列邊界，為對Lrrcl0基因表達(dá)調(diào)控的進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)。 方法：①通過internet訪問公共數(shù)據(jù)庫，獲得不同物種LrrclO同源基因的cDNA序列、同源EST序

2、列及組織來源信息、蛋白序列、ORF上游基因組DNA序列、基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行多重序列比對。②根據(jù)L,rrclO基因上游序列設(shè)計引物，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從小鼠基因組DNA中擴(kuò)增L,rrcl0基因ORF上游1900bp的侯選啟動子序列和1200bp和700bp兩個截短序列；PCR產(chǎn)物經(jīng)Kpn I和HindIII雙酶切后與PGL3-Basic載體連接，菌落PCR篩選陽性克隆，酶切和測序驗證插入片段的正確性。③將構(gòu)建的重組載

3、體用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染hela和C2C12細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24h后，檢測熒光素酶的表達(dá)值。 結(jié)果：①已在8個物種中發(fā)現(xiàn)L,rrclO同源基因，同源基因間蛋白序列具有較高的保守性；各物種Lrrcl0的同源EST主要來自心肌，GNFlM Mo,Jse Chip數(shù)據(jù)顯示LrrclO在心臟和其它組織間差異表達(dá)；不同物種Lrrcl0同源基因的ORF上游基因組DNA在400bp范圍內(nèi)有顯著的序列相似性。②根據(jù)L.rrclO基因上游序列設(shè)計的引物從小

4、鼠基因組DNA成功擴(kuò)增了三個分別為1900bp、1200bp汞]700bp的預(yù)期片段，三個片段分別與PGL3一Basic連接獲得陽性克隆，提取的質(zhì)粒經(jīng)過KpnI平flHindIII雙酶切驗證正確，DNA測序結(jié)果表明插入片段序列與L,rrcl0基因上游相對應(yīng)的基因組DNA序列一致。構(gòu)建3個重組載體。③3個重組載體轉(zhuǎn)染hela和CaC~2后檢測報告基因表達(dá)，結(jié)果表明，不同長度的L,rrclO啟動子截短序列的活性具有明顯差異。在hela細(xì)胞租

5、C2C12細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染L,rrclOpro.1900后檢測到較強的熒光素酶活性，而轉(zhuǎn)染LrrclOpro.1200產(chǎn)生明顯的報告基因表達(dá)活性，但較LrrclOpro.1900轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的報告基因表達(dá)活性低。轉(zhuǎn)染LrrclOpr0700的細(xì)胞幾乎檢測不到報告基因的表達(dá)。 結(jié)論：Lrccl0載體構(gòu)建成功；1900bp和1200bp的啟動子截短序列具有明顯的啟動子活性，1900bp的啟動子序列活性最強，可能與LrrclO啟動子的轉(zhuǎn)錄活性