雞MTNR1A基因啟動子克隆及活性分析.pdf

1、MTNR1A基因編碼褪黑激素受體1A，是影響雞產(chǎn)蛋性狀的候選基因。通過對MTNR1A基因啟動子區(qū)的功能分析，有助于從分子水平上了解MTNR1A基因可能的調(diào)控序列及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，對進一步了解褪黑激素參與生殖調(diào)控的作用機制也有一定作用。
　　本試驗以海蘭褐殼蛋雞為研究對象，采用PCR方法擴增了雞MTNR1A基因5’調(diào)控區(qū)3134bp到205bp長度不同、下游引物相同的七個片段，對其進行克隆、測序后，構(gòu)建了七個啟動子報告基因表達載體，瞬

2、時轉(zhuǎn)染雞卵泡膜細胞，應(yīng)用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測定了熒光素酶相對活性，并對產(chǎn)生作用的區(qū)段進行生物信息學(xué)分析。同時，PCR擴增31只雞MTNR1A基因5’調(diào)控區(qū)-941~+107區(qū)域進行測序，尋找其SNP位點，對SNP位點進行遺傳學(xué)分析，并對突變前后基因序列進行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：
　?。?）-243~-39區(qū)段能表達MTNR1A基因啟動子的基本活性。生物信息學(xué)分析表明，該區(qū)域包含TATA box、CCAAT box等典型

3、的核心啟動子元件。表明-243~-39區(qū)段對該基因的表達調(diào)控起重要作用。
　　（2）啟動子分析載體由-553~-39刪除至-243~-39時，熒光素酶活性顯著下降，表明-553~-243間有增強MTNR1A基因表達的作用元件。該區(qū)域存在多個SP1結(jié)合位點和USF結(jié)合位點，推測這兩種結(jié)合位點對-553~-243區(qū)域活性增強起重要作用。
　　（3）啟動子分析載體由-1963~-39刪除至-1525~-39時，熒光素酶結(jié)果顯著升高

4、，表明-1963~-1525間有降低MTNR1A基因表達的作用元件。推測該區(qū)域的AP-1結(jié)合位點、HNF-1結(jié)合位點、USF結(jié)合位點及Arnt反式作用因子發(fā)揮降低啟動子活性的作用。
　　（4）啟動子分析載體由-2373~-39刪除至-1963~-39時，熒光素酶活性顯著降低，表明從-2373~-1963區(qū)域中存在增強MTNR1A基因表達的作用元件。推測該區(qū)域的TATA box、AP-1結(jié)合位點、c-Myb結(jié)合位點、USF結(jié)合位點和

5、Oct-1反式作用因子起到增強-2373~-1963區(qū)域活性的作用。
　　（5）啟動子-941~+107區(qū)域存在6個SNPs位點：-34（C→T），-100(T→G)，-110(T→C)，-126(C→T)，-151(G→A)，-538(T→G)，處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。其中2個突變可能造成轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的改變。
　　綜上所述，本試驗證明MTNR1A基因-553~-243和-2373~-1525區(qū)段是調(diào)控