水曲柳節(jié)律基因LHY啟動(dòng)子克隆及功能研究.pdf

1、本研究以水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.)為材料，運(yùn)用改良Site Finding-PCR法分離了LHY基因啟動(dòng)子序列，并對(duì)其順式作用元件進(jìn)行分析。構(gòu)建了植物瞬時(shí)表達(dá)載體pPXGFP-P-LHY和植物表達(dá)載體pPCXGUS-P-LHY，通過(guò)GFP檢測(cè)、GUS組織化學(xué)染色研究LHY基因啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性;通過(guò)GFP檢測(cè)、GUS酶活力檢測(cè)、GUS基因定量分析研究LHY基因啟動(dòng)子對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)。研究干旱誘導(dǎo)的水曲

2、柳親本及雜交F1代DNA甲基化模式的變化，探究其與水曲柳耐旱雜種優(yōu)勢(shì)的關(guān)系。主要結(jié)果如下：
　　1、水曲柳LHY基因啟動(dòng)子的克隆及其活性分析
　　克隆了水曲柳LHY基因上游啟動(dòng)子區(qū)(1360 bp)。生物信息分析表明該啟動(dòng)子中含有重要的轉(zhuǎn)錄必備元件（TATA box、CAAT box）、逆境調(diào)控元件（如抗旱響應(yīng)元件）、激素響應(yīng)元件（如赤霉素、茉莉酸等的調(diào)控元件）、光響應(yīng)元件(AE-box、BOXI、GAG-motif、LAM

3、P-element等)及節(jié)律相關(guān)的Circadian元件。轉(zhuǎn)化煙草并進(jìn)行GFP檢測(cè)和GUS組織染色結(jié)果顯示，LHY基因啟動(dòng)子具有啟動(dòng)活性。
　　2、LHY啟動(dòng)子對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)
　　pPXGFP-P-LHY侵染的白樺懸浮細(xì)胞，測(cè)定其對(duì)非生物脅迫(NaCl)下的響應(yīng)。GFP檢測(cè)結(jié)果顯示，重組表達(dá)載體pPXGFP-P-LHY中的啟動(dòng)子LHY能夠啟動(dòng)表達(dá)。在非生物脅迫下，啟動(dòng)子仍可啟動(dòng)表達(dá)，從熒光的明亮程度看，與對(duì)照相比較，在鹽

4、脅迫下表達(dá)水平相對(duì)升高了。
　　pPCXGUS-P-LHY侵染的煙草植株，測(cè)定其對(duì)非生物脅迫(NaCl、PEG)下的響應(yīng)。GUS酶活力和GUS基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的定量分析顯示，GUS酶活力/GUS基因相對(duì)表達(dá)量隨著干旱、鹽脅迫時(shí)間的增加先升高后降低，在干旱脅迫3h的時(shí)候GUS酶活力/GUS基因相對(duì)表達(dá)量最高，在鹽脅迫6h的時(shí)候GUS酶活力/GUS基因相對(duì)表達(dá)量最高，高于對(duì)照組。說(shuō)明在非生物脅迫下，LHY啟動(dòng)子仍可肩動(dòng)表達(dá)。且LHY基因啟

5、動(dòng)子中的逆境調(diào)控元件對(duì)非生物脅迫產(chǎn)生了響應(yīng)。
　　3、節(jié)律基因LHY啟動(dòng)子區(qū)及編碼區(qū)甲基化分析
　　以干旱處理的父本、母本、雜交子代（水曲柳做母本、大葉白蠟做父本雜交所得的白蠟屬種間雜種F1）水曲柳為材料。用亞硫酸鹽處理測(cè)序法對(duì)LHY基因啟動(dòng)子區(qū)及編碼區(qū)甲基化分析顯示，和對(duì)照組及處理組親本相比，只有干旱處理的雜交子代中某些甲基化水平降低且某些原本甲基化的位點(diǎn)發(fā)生了去甲基化。LHY基因熒光定量結(jié)果顯示，干旱脅迫下雜交子代的相對(duì)