載脂蛋白M基因啟動子的克隆及功能初步研究.pdf

1、目的：
　　克隆apoM基因的上游啟動子序列，構(gòu)建不同啟動子截短片段的熒光素酶報(bào)告基因，并觀察其不同截短片段的啟動子活性，為研究該基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　首先應(yīng)用5’RACE(rapid amplification of cDNA ends，cDNA末端快速擴(kuò)增)技術(shù)確定了apoM基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，以HepG2基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增方法獲得一系列不同大小的apoM啟動子片段，將擴(kuò)增的

2、不同大小的啟動子片段與pMD19-T載體連接進(jìn)行T-A克隆，鑒定出正確的克隆后，再用加在引物上的XhoⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)所對應(yīng)的內(nèi)切酶酶切，將酶切所得的目的片段定向克隆入經(jīng)同樣酶切的pGL3-Basic載體中，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體，在陽離子脂質(zhì)體的介導(dǎo)下，報(bào)告基因載體瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，并觀察其不同截短片段的啟動子活性。
　　結(jié)果：
　　1、5’RACE技術(shù)確定了apoM基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。
　　2、用PC

3、R和酶切方法得到了不同長度的apoM基因啟動子區(qū)域的片段。
　　3、成功構(gòu)建了不同長度的apoM基因啟動子區(qū)pGL3-Basic重組質(zhì)粒。
　　4、pGL3-Basic-B的熒光素酶活性與pGL3-Basic-A熒光素酶活性相比有所升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）；pGL3-Basic-A和pGL3-Basic-B的熒光素酶活性值低于pGL3-Basic空載體；pGL3-Basic-C的熒光素酶活性與pGL3-Basi

4、c-B的的熒光素酶活性相比顯著升高，兩組比較p<0.01；pGL3-Basic-D的熒光素酶活性與pGL3-Basic-C相比明顯降低，兩組比較p<0.01；pGL3-Basic-E的熒光素酶活性與 pGL3-Basic-D的熒光素酶活性相比明顯升高，兩組比較 p<0.01；pGL3-Basic-F的熒光素酶活性與pGL3-Basic-E的熒光素酶活性相比有所升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、ap