棉花GaMYB7和GbGLU基因啟動(dòng)子的克隆和初步功能驗(yàn)證.pdf

1、棉花是第一大天然纖維產(chǎn)物，在世界紡織工業(yè)中具有重要的經(jīng)濟(jì)地位。隨著人們生活水平的提高和紡織技術(shù)的進(jìn)步，也對(duì)棉纖維品質(zhì)提出了更高的要求。而闡明纖維發(fā)育的細(xì)胞和分子機(jī)理，發(fā)現(xiàn)改良棉纖維的靶基因，是改良纖維品質(zhì)的基礎(chǔ)。研究這些棉花纖維特異基因的啟動(dòng)子既有助于進(jìn)一步明確該基因的功能，也為基因工程的研究打下了基礎(chǔ)。 棉花黃萎病(Verticillium spp)是棉花生長(zhǎng)過(guò)程中最具破壞力的病害之一，在世界范圍內(nèi)流行。在我國(guó)，棉花黃萎病是棉

2、花生產(chǎn)的主要障礙之一。使用棉花黃萎病病原誘導(dǎo)的啟動(dòng)子來(lái)介導(dǎo)抗病基因的表達(dá)，不僅會(huì)獲得目的產(chǎn)物、達(dá)到預(yù)定目標(biāo)，而且也不會(huì)產(chǎn)生副作用。植物抗病相關(guān)啟動(dòng)子的調(diào)控特性研究、分離及其應(yīng)用對(duì)于提高植物抗病性極其關(guān)鍵。 本研究選取了兩個(gè)目標(biāo)基因，棉花花和纖維特異表達(dá)基因GaMYB7和棉花黃萎病誘導(dǎo)表達(dá)基因GbGLU，克隆了這兩個(gè)基因的啟動(dòng)子序列，具體工作如下： 1.通過(guò)篩選江陵中棉BAC文庫(kù)的方法，得到了含有GaMYB7基因的陽(yáng)性單克

3、隆，以此作為T(mén)AIL-PCR的起始模板，獲得的總長(zhǎng)度1566bp的GaMYB7基因上游序列。經(jīng)過(guò)序列分析確定了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)、TATA box和CAATbox。通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)，該序列包含多個(gè)光調(diào)控元件，還具有生長(zhǎng)素和赤霉素應(yīng)答的基本結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了3個(gè)5'端啟動(dòng)子片段驅(qū)動(dòng)GUS基因的植物表達(dá)載體。通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)化棉花胚珠瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三個(gè)啟動(dòng)子片段均能指導(dǎo)報(bào)告基因在棉花胚珠中正常表達(dá)。TM-1棉花ODPA胚珠離體誘導(dǎo)

4、實(shí)驗(yàn)表明，GaMYB7基因的表達(dá)受GA3和IAA濃度的影響，10uMIAA時(shí)，GaMYB7基因的表達(dá)量最高；但是過(guò)高濃度的GA3會(huì)抑制GaMYB7基因的表達(dá)。在20001x的光照強(qiáng)度下誘導(dǎo)處理棉花胚珠發(fā)現(xiàn)，與暗處理相比，早期(10天之前)光照處理可以有效提高GaMYB7基因的表達(dá)量；后期(10天之后)反而會(huì)抑制GaMYB7基因的表達(dá)。因此，GaMYB7啟動(dòng)子可用于研究棉花纖維的發(fā)育、品質(zhì)改良以及外源基因在棉花纖維中的特異表達(dá)。

5、2.通過(guò)篩選陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1 BAC文庫(kù)，得到了GbGLU基因的陽(yáng)性單克隆，以此作為T(mén)AIL-PCR的起始模板，分離了GbGLU基因5'側(cè)翼序列，總長(zhǎng)度為1357bp。PLACE分析表明，該序列含有TATA box和CAAT box，還有病原菌誘發(fā)子反應(yīng)元件W-box、GT-1、MYB、MYBST1等。將GbGLU基因5'側(cè)翼序列以不同的缺失與GUS基因融合構(gòu)建了3個(gè)植物表達(dá)載體。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化棉花胚性愈傷發(fā)現(xiàn)，三個(gè)啟動(dòng)子片