一個(gè)新的玉米啟動(dòng)子克隆及功能的初步驗(yàn)證.pdf

1、植物基因工程研究的中心內(nèi)容之一是基因的表達(dá)和調(diào)控，啟動(dòng)子及其順式作用元件在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控上起重要作用，已經(jīng)成為分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。目前，在植物轉(zhuǎn)基因工程中最常用的啟動(dòng)子還是組成型啟動(dòng)子，驅(qū)動(dòng)外源基因在所有組織器官中過量表達(dá)，對(duì)于選擇標(biāo)記基因等一些不需要過量表達(dá)的外源基因，不分空間和時(shí)間的過量表達(dá)，表達(dá)會(huì)大量消耗營(yíng)養(yǎng)和能量，而抑制植物其他的生理代謝活動(dòng)，影響植物正常生長(zhǎng)發(fā)育，增加轉(zhuǎn)基因植物的適應(yīng)性代價(jià)。因此，為了克服組成型啟動(dòng)子的這些缺

2、點(diǎn)，有時(shí)需要驅(qū)動(dòng)外源基因在轉(zhuǎn)基因植物特定時(shí)間及特定部位表達(dá)，并且啟動(dòng)活性適中的特異性啟動(dòng)子。
　　在對(duì)玉米PPR(Pentatricopeptide repeats)基因家族做全基因組分析時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)序列編號(hào)為GRMZM2G129783的成員在葉片中有適中的特異性表達(dá)，推測(cè)該基因的啟動(dòng)子可能是一個(gè)啟動(dòng)活性適中的葉片特異性啟動(dòng)子。因此，本研究在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，克隆PPRGRZM2G129783基因全長(zhǎng)啟動(dòng)子pPPR1

3、830及其5'-端缺失不同順式作用元件的序列片段，構(gòu)建驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草，通過GUS組織化學(xué)染色和GUS酶活測(cè)定，初步驗(yàn)證其特異性啟動(dòng)子的功能。結(jié)果如下:
　　(1)熒光定量PCR檢測(cè)表明，PPRGRMZM2G129783基因只在幼苗的莖葉中表達(dá)，在根部幾乎不表達(dá)，推測(cè)該基因的啟動(dòng)子可能為綠色組織特異性啟動(dòng)子。
　　(2)利用PLACE和PlantCARE數(shù)據(jù)庫，對(duì)PRGRMZM2G129783基因全長(zhǎng)啟

4、動(dòng)子pPPR1830進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，該啟動(dòng)子除含有TATAbox和Inr核心啟動(dòng)子元件外，還含有3-AF1 binding site、GT-1 motif、 G-box、I-box、CATT motif、-10promoter element、ATCT motif七種光應(yīng)答相關(guān)元件;MBS、LTRE、ABRE、CGTCAmotif和ARF五種逆境誘導(dǎo)性相關(guān)元件，以及與根特異性表達(dá)相關(guān)的ROOTMOTIFTAPOX1元件。
　　(

5、3)從玉米自交系B73基因組中克隆得到的PPRGRMZM2G129783基因的啟動(dòng)子，全長(zhǎng)1830bp，命名為pPPR1830。根據(jù)序列分析結(jié)果，將全長(zhǎng)啟動(dòng)子序列從5'-端截短成1387、437、146和128bp的不同長(zhǎng)度序列，分別命名為pPPR1387、pPPR437、pPPR146和pPPR128，用以替換雙子葉植物表達(dá)載體pRI201-AN-35S-GUS上的35S啟動(dòng)子，分別構(gòu)建5個(gè)表達(dá)載體pRI201-AN-pPPR1830

6、-GUS、pRI201-AN-pPPR1387-GUSpRI201-AN-pPPR437-GUS、 pRI201-AN-pPPR146-GUS和pRI201-AN-pPPR128-GUS。
　　(4)用上述5個(gè)表達(dá)載體分別注射煙草葉片，并以pR1201-AN-35S-GUS為陽性對(duì)照，通過GUS組織化學(xué)染色，檢測(cè)GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)，對(duì)不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)錄活性做定性鑒定。結(jié)果表明，除全長(zhǎng)啟動(dòng)子序列pPPR1830外，其他4種不

7、同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子序列均能驅(qū)動(dòng)GUS基因在煙草葉片中表達(dá)。
　　(5)用上述5個(gè)表達(dá)載體，并以pRI201-AN-35S-GUS為陽性對(duì)照，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，獲得25個(gè)T0代陽性植株。其中pPPR1830轉(zhuǎn)化5株，pPPR1387轉(zhuǎn)化3株，pPPR437轉(zhuǎn)化4株，pPPR146轉(zhuǎn)化4株，pPPR128轉(zhuǎn)化3株，陽性對(duì)照6株。
　　(6) GUS組織化學(xué)性染色和GUS酶活性檢測(cè)表明，全長(zhǎng)啟動(dòng)子序列pPPR1830和5'-端缺失

8、的pPPR1387、pPPR437啟動(dòng)子序列在根、莖、葉中均能驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)，但其活性均低于陽性對(duì)照35S。但pPPR146和pPPR128序列僅在莖和葉中有啟動(dòng)活性，而在根中沒有啟動(dòng)活性。此外，全長(zhǎng)啟動(dòng)子序列pPPR1830在根、莖、葉中的啟動(dòng)活性均低于5'-端缺失的pPPR1387啟動(dòng)子序列，在莖和葉中還低于pPPR437啟動(dòng)子序列。由此推斷，在pPPR1830啟動(dòng)子的5'-端序列中可能存在負(fù)調(diào)控元件。
　　由此推斷，pP