兩個(gè)玉米逆境脅迫啟動(dòng)子的功能驗(yàn)證.pdf

1、玉米在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)受到許多不良環(huán)境條件的脅迫，嚴(yán)重影響玉米生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量。其中，以干旱、低溫和鹽漬等非生物逆境脅迫最為嚴(yán)重。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)化培育抗逆新品種，是解決這些問(wèn)題的關(guān)鍵之一。然而，在很多抗逆轉(zhuǎn)基因研究中，都采用組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)抗逆基因的表達(dá)。雖然提高了對(duì)非生物逆境的抵抗能力，但在沒(méi)有受脅迫時(shí)基因的過(guò)量表達(dá)，卻造成了能源的浪費(fèi)，對(duì)植物自身的一些生理代謝活動(dòng)卻產(chǎn)生了抑制作用，反而導(dǎo)致植株矮小，產(chǎn)量降低。再者，因?yàn)榉N屬之間存在特

2、異性，外源誘導(dǎo)啟動(dòng)子的啟動(dòng)效能一般不及內(nèi)源啟動(dòng)子。目前關(guān)于玉米內(nèi)源逆境誘導(dǎo)啟動(dòng)子的研究比較少。因此，克隆驗(yàn)證玉米內(nèi)源誘導(dǎo)啟動(dòng)子，并研究其表達(dá)調(diào)控機(jī)制，有利于了解玉米脅迫應(yīng)答機(jī)制，為玉米抗逆轉(zhuǎn)基因研究提供更多的選擇。
　　在前期研究中，我們從玉米中克隆了MGL3s和sbCBF6s啟動(dòng)子，經(jīng)瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證具有多種非生物脅迫誘導(dǎo)活性。MGL3s在非脅迫條件下啟動(dòng)活性較低，在干旱、高鹽等脅迫條件下啟動(dòng)活性較高。而sbCBF6s的啟動(dòng)活性對(duì)干

3、旱、高鹽、ABA等非生物逆境脅迫的響應(yīng)不顯著，只有在低溫脅迫下升高。為進(jìn)一步驗(yàn)證這兩個(gè)啟動(dòng)子在非生物逆境脅迫下的啟動(dòng)活性，并評(píng)價(jià)不同順式作用元件對(duì)啟動(dòng)活性的影響，本研究先用植物啟動(dòng)子分析軟件PlantCARE查找MGL3s和sbCBF6s序列內(nèi)的TGACG、MBS、CGTCA、ARE、 HSE等與滲透脅迫相關(guān)及溫度相關(guān)的順式作用元件。然后根據(jù)分析結(jié)果設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增去除不同順式作用元件的5'-端缺失啟動(dòng)子序列，構(gòu)建啟動(dòng)GUS基因的表

4、達(dá)載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥或煙草。用20％聚乙二醇-6000模擬干旱、0.4 mol/L NaC1高滲及對(duì)照條件處理T1代擬南芥，誘導(dǎo)MGL3s啟動(dòng)子啟動(dòng)GUS基因的表達(dá)。GUS組織化學(xué)染色結(jié)果表明，5'-端缺失不同長(zhǎng)度的5個(gè)MGL3s啟動(dòng)子序列啟動(dòng)的GUS基因，在擬南芥轉(zhuǎn)化體的葉脈或莖中都只有微弱表達(dá)。5'-端缺失不同長(zhǎng)度的MGL3s和sbCBF6s啟動(dòng)子序列，均能在轉(zhuǎn)化煙草葉盤(pán)在抗性培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的陽(yáng)性愈傷中啟動(dòng)GUS基因的表達(dá)。

5、MGL3s和sbCBF6s啟動(dòng)子能夠保持啟動(dòng)活性的最短片段分別為325 bp（-175 bp至+150 bp）和185 bp（-77 bp至+108 bp）。
　　上述結(jié)果說(shuō)明，MGL3s啟動(dòng)子具有單子葉植物特異性，在雙子葉植物擬南芥中只能啟動(dòng)基因的微弱表達(dá)。MGL3s啟動(dòng)子保持啟動(dòng)活性的最短序列是從+150bp上游的325bp序列。sbCBF6s可在單子葉和雙子葉植物中啟動(dòng)基因表達(dá)，保持啟動(dòng)活性的最短序列是從+108bp上游的1