玉米蟲害誘導基因啟動子的研究.pdf

1、植物在感知到蟲害信號后會發(fā)生復雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，開啟防御基因的表達。這一過程涉及介導防御反應的轉(zhuǎn)錄因子和防御基因啟動子上受到蟲害誘導的順式元件，并且受到茉莉酸信號途徑的調(diào)控。本實驗利用RNA-seq技術系統(tǒng)研究了玉米在玉米螟咬食和茉莉酸處理后的轉(zhuǎn)錄組變化，并確定了受蟲害和茉莉酸強烈誘導的候選基因?？寺『蜻x基因啟動子，并檢測其在擬南芥中是否也具有受茉莉酸或蟲害誘導的特性。通過對這些候選基因的研究，完善對于植物防御反應中表達調(diào)控機制的理解，并期

2、待獲得蟲害誘導高表達的啟動子，為生產(chǎn)實踐提供依據(jù)。
　　本實驗利用實驗室前期構(gòu)建的RNAseq數(shù)據(jù)，從中選取了受蟲害和茉莉酸強烈誘導的兩個基因，Zm281(GRMZM2G117281)、ZmP al（GRMZM2G154523）分別克隆候選基因ATG前1815bp、1655bp啟動子序列，連接pBAR-GUS表達載體，該載體以Basta作為篩選劑，以GUS為篩選標記基因。利用花序浸染法將植物表達載體轉(zhuǎn)化擬南芥，共轉(zhuǎn)化擬南芥植株15

3、0余株。Basta初步篩選后移栽，CTAB法提取擬南芥DNA，PCR法檢測陽性植株。獲得T0代陽性植株收獲種子。
　　隨后為確定啟動子的組織特異性，利用MeJA處理T1代植株進行GUS組織化學染色，觀察染色情況。發(fā)現(xiàn)候選基因啟動子在不做處理時GUS染色未顯現(xiàn)顏色，受到MeJA處理后顯藍色，并在根莖葉花等組織均顯藍色，可初步判定該啟動子為誘導型啟動子。
　　采用熒光分析法測定GUS活性，以單位時間內(nèi)單位蛋白產(chǎn)生4-methlu

4、m bellifer one(MU)的量比較各啟動子對GUS基因表達的影響。發(fā)現(xiàn)陽性植株在受到MeJA誘導后，GUS表達量升高。對幼苗期及成熟期分析發(fā)現(xiàn)GUS表達量基本不變
　　對上述兩個基因進行進一步分析，對生長三周的玉米噴灑200μmol/L的MeJA溶液，處理后的材料分時間段(0h、1h、2h、4h、6h、16h)取葉片提取RNA。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA進行實時熒光定量PCR。結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因在受到MeJA誘導后1h-8h表達量成明