丹參psbD基因啟動(dòng)子初步研究.pdf

1、丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge.)根莖是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，具有較高藥用價(jià)值。目前丹參藥材主要以人工種植滿(mǎn)足市場(chǎng)需求，但時(shí)常遭受季節(jié)性干旱造成死苗或影響產(chǎn)量。研究已發(fā)現(xiàn)，丹參葉綠體對(duì)中度以上干旱非常敏感，常造成光合作用功能下降，但其機(jī)理不清楚。
　　光系統(tǒng)Ⅱ具有吸取光能、引發(fā)電荷分離、傳遞電子并且催化水分解功能。D2蛋白是組成光系統(tǒng)Ⅱ復(fù)合體的核心之一，研究其編碼的psbD基因，對(duì)揭示丹參光合作用機(jī)理具有重要意

2、義。本研究選取陜西天士力公司提供的優(yōu)良丹參SH-B，對(duì)psbD基因上游1355bp片段進(jìn)行克隆，并以全長(zhǎng)啟動(dòng)子為模板設(shè)計(jì)出5'端缺失啟動(dòng)子片段，再分別與報(bào)告基因GUS相融合，構(gòu)建多個(gè)表達(dá)載體，使用GV3101農(nóng)桿菌浸染本氏煙草葉片，分析各啟動(dòng)子片段瞬時(shí)表達(dá)差異，從而驗(yàn)證psbD基因啟動(dòng)子功能，旨在為后續(xù)研究丹參響應(yīng)干旱脅迫的光合作用機(jī)理及與育性之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。取得的主要結(jié)果如下:
　　(1)以丹參葉綠體DNA為模板克隆了丹參p

3、sbD基因上游啟動(dòng)子區(qū)(1355bp)。在PLACE網(wǎng)站上分析全長(zhǎng)啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)含有多個(gè)與外部環(huán)境有關(guān)的順式作用元件，如CAAT-box、ATCA-motif、MBS等。
　　(2)用Primer5.0設(shè)計(jì)特異引物，以全長(zhǎng)啟動(dòng)子為模板，克隆出1147bp，891bp，746bp，582bp，451bp，323bp，230bp，142bp8個(gè)5'端缺失片段。將全長(zhǎng)啟動(dòng)子以及8個(gè)5'端啟動(dòng)子缺失序列與去除CaMV35S啟動(dòng)子的pCAMB

4、IA1304連接，成功構(gòu)建出表達(dá)載體，按序列長(zhǎng)度分別定名為:SalP-1355、SalP-1147、SalP-891、SalP-746、SalP-582、SalP-451、SalP-323、SalP-230、SalP-142。
　　(3)將已構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)GV3101農(nóng)桿菌，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染本氏煙草葉片，對(duì)葉片進(jìn)行GUS染色分析，結(jié)果顯示，全長(zhǎng)啟動(dòng)子以及各5'端缺失啟動(dòng)子均可驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)，且各啟動(dòng)子活性有明顯差異。