脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子變異的功能研究.pdf

1、目的:脂聯(lián)素(Adiponectin)是脂肪細(xì)胞特異性分泌的一種蛋白。研究表明血清脂聯(lián)素水平與代謝綜合征和腫瘤相關(guān)，而脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子變異影響其功能的發(fā)揮。我們前期探討了脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)SNP多態(tài)性與云南漢族人群非小細(xì)胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC)發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)SNP-12140G等位基因有可能是NSCLC的危險(xiǎn)因素(OR=1.516;95％ CI:1.098-2.094)。為更深

2、一步地闡明脂聯(lián)素基因結(jié)構(gòu)變異和mRNA的關(guān)系，在本研究中，我們將對(duì)脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子變異的功能進(jìn)行初步探討。
　　方法:1.利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)擴(kuò)增APM1基因啟動(dòng)子區(qū);2.將APM1基因啟動(dòng)子區(qū)連接至螢火蟲(chóng)螢光素酶報(bào)告基因載體pGL4.11上，構(gòu)建螢火蟲(chóng)螢光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒;3.利用多位點(diǎn)基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖袑?duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行基因突變，獲得包含3個(gè)SNP(SNP-12140

3、G＞A，SNP-11426A＞G，SNP-11377C＞G)不同組合的8個(gè)單倍體的螢火蟲(chóng)螢光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒。4.測(cè)序分析重組質(zhì)粒是否突變成功;5.重組質(zhì)粒與海腎熒光素酶報(bào)告基因pGL4.74共轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)分化第八天的小鼠前脂肪細(xì)胞3T3 L1;6.轉(zhuǎn)染后48h檢測(cè)螢火蟲(chóng)螢光素酶的活性以反映所連接的啟動(dòng)子變異的作用。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建重組質(zhì)粒，并完成基因定點(diǎn)突變;獲得8中不同SNP組合的單倍體重組質(zhì)粒;瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小鼠前脂肪細(xì)胞3T

4、3L1，不同單倍型的重組質(zhì)粒表達(dá)的熒光素酶報(bào)告基因活性具有差異;在8種重組質(zhì)粒中，具有SNP-11377C＞G的C等位基因的單倍型重組質(zhì)粒的螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因活性的表達(dá)量高于G等位基因的重組質(zhì)粒;在SNP-11377C＞G等位基因?yàn)镚的4種重組質(zhì)粒中，SNP-12140G＞A的A等位基因的重組質(zhì)粒所表達(dá)的螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因活性高于G等位基因的重組質(zhì)粒;SNP-11426基因型與熒光素酶活性表達(dá)沒(méi)有明顯的關(guān)系。
　　結(jié)論:脂