牛α-actin基因啟動(dòng)子的改造及其功能驗(yàn)證.pdf

1、培養(yǎng)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的肉牛一直是畜牧生產(chǎn)所追求的目標(biāo)。傳統(tǒng)的雜交育種方法存在效率低，周期長等問題。轉(zhuǎn)基因技術(shù)可在較短時(shí)間內(nèi)培育出具有優(yōu)質(zhì)性狀的肉牛新品種，應(yīng)用前景廣泛。高效肌肉特異性啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)外源基因在骨骼肌細(xì)胞中的高效表達(dá)，對(duì)于提高肌肉產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因肉牛生產(chǎn)具有重要意義。骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白(α-actin)所編碼的蛋白質(zhì)是骨骼肌中肌動(dòng)蛋白的主要成分。本研究以牛α-actin基因啟動(dòng)子為對(duì)象，通過分子克隆技術(shù)對(duì)其啟動(dòng)子片段進(jìn)行改造，期望篩選

2、出活性較高且具有肌肉組織特異性的啟動(dòng)子，為今后肉質(zhì)性狀改良相關(guān)的牛轉(zhuǎn)基因研究提供合適的肌肉特異性啟動(dòng)子。
　　通過PCR定點(diǎn)突變啟動(dòng)子特定轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件;在其上游和下游連接內(nèi)含子;連接MyoG基因的啟動(dòng)子構(gòu)建雙啟動(dòng)子;增加正調(diào)控元件拷貝數(shù)等方法改造牛骨骼肌α-actin基因啟動(dòng)子;構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒;瞬時(shí)轉(zhuǎn)染牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞，檢測(cè)啟動(dòng)子的肌肉特異性和表達(dá)效率。最后選擇經(jīng)過改造后活性較高的啟動(dòng)子來驗(yàn)證其對(duì)牛骨骼

3、肌α-actin基因表達(dá)的影響，具體研究內(nèi)容及結(jié)果為:
　　1.針對(duì)牛骨骼肌α-actin基因啟動(dòng)子，分析確定α-actin啟動(dòng)子中特定核苷酸序列的功能，應(yīng)用PCR定點(diǎn)突變的方法，定點(diǎn)突變牛α-actin啟動(dòng)子缺失片段389bp中的Sp1/KLFs元件、430bp中的ZF5F元件和490bp中的Pax3元件;結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Sp1/KLFs突變后啟動(dòng)子活性增強(qiáng)，為負(fù)調(diào)控元件;ZF5F和Pax3突變后啟動(dòng)子活性減弱，為牛α-actin啟動(dòng)

4、子的正調(diào)控元件。
　　2.根據(jù)GenBank上公布的序列，將牛骨骼肌α-actin基因的內(nèi)含子Ⅰ和內(nèi)含子Ⅱ，分別連在pGL3-α-actinp262的上游和下游，證明內(nèi)含子Ⅰ和內(nèi)含子Ⅱ插入啟動(dòng)子上游時(shí)均能提高啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性且具有肌肉特異性，而這兩個(gè)內(nèi)含子在啟動(dòng)子下游時(shí)并不提高啟動(dòng)子活性，證明內(nèi)含子可以影響α-actin基因啟動(dòng)子活性，且具有位置效應(yīng)。
　　3.將MyoG基因啟動(dòng)子連接到牛α-actin基因啟動(dòng)子之前并構(gòu)建了雙

5、啟動(dòng)子真核表達(dá)載體pGL3-MyoGp373-α-actinp262。結(jié)果表明雙啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性較牛MyoG和α-actin基因啟動(dòng)子活性都顯著提高，且保持較好的肌肉特異性。
　　4.通過PCR擴(kuò)增牛α-actin基因啟動(dòng)子中含有多個(gè)正調(diào)控元件的170bp序列，插入到啟動(dòng)子上游，構(gòu)建含有兩個(gè)和三個(gè)這一序列拷貝的重組質(zhì)粒，并構(gòu)建連接MyoG基因啟動(dòng)子部分調(diào)控元件的牛α-actin基因啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)增加調(diào)控元件拷貝數(shù)后牛α-actin基