擬南芥抗致病疫霉相關(guān)基因ACS9的功能驗證及其啟動子活性研究.pdf

1、乙烯作為一種植物激素，對植物種子萌發(fā)、生長發(fā)育、衰老、果實成熟、性別決定等都有著重要的影響，同時參與抵抗逆境脅迫如機械傷害、冷害、漬水、病原菌入侵等以及參與植物細胞的程序性死亡。ACC合酶是乙烯合成途徑中的限速酶，本實驗室在前期研究中利用致病疫霉接種不同生態(tài)型擬南芥，初步確定ACC合酶中的ACS9基因為抗致病疫霉相關(guān)基因。為了深入研究ACC合酶參與抗致病疫霉的機制和信號傳導途徑，本試驗利用反義RNA和RNAi技術(shù)對ACS9基因功能進行了

2、初步研究。克隆了ACS9基因上游不同長度的調(diào)控序列，并構(gòu)建了GUS表達載體，研究了該基因的表達特性。結(jié)果如下：
　　 （1）構(gòu)建了ACS9基因反義RNA和RNAi載體pCAMBIA1300-ACS9A和pCAMBIA1300-ACS9i。將pCAMBIA1300-ACS9A和pCAMBIA1300-ACS9i載體經(jīng)農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化擬南芥。通過潮霉素篩選，得到了18株反義RNA轉(zhuǎn)化子和13株RNAi轉(zhuǎn)化子。經(jīng)PCR鑒定，外源基因已成

3、功整合到了轉(zhuǎn)基因植株的基因組中。RT-PCR結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株中ACS9基因的表達均受到不同程度的抑制，確定所得轉(zhuǎn)基因植株均為ACS9基因的（反義RNA/RNAi）突變體。
　　 （2）經(jīng)RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，突變體病害防御反應(yīng)中乙烯信號轉(zhuǎn)導途徑的下游基因PDF1.2的表達受到了抑制；對突變體進行暗培養(yǎng)，“三重反應(yīng)”消失；突變體接種致病疫霉后表現(xiàn)感病癥狀，確定ACS9基因參與了調(diào)控擬南芥中乙烯介導的病害防御反應(yīng)。
　　

4、 （3）用PLACE和PLANTCARE軟件分析ACS9基因的啟動子，發(fā)現(xiàn)該序列具有啟動子的基本元件TATA-box和CAAT-box，此外還發(fā)現(xiàn)了光應(yīng)答元件G-Box、GATA和刺激誘導元件MBS和LTR等多個順式作用元件。
　　 （4）成功構(gòu)建了帶有GUS報告基因的含有ACS9基因不同長度調(diào)控序列的植物表達載體，發(fā)現(xiàn)不同長度的調(diào)控序列均具有啟動子活性；GUS瞬時表達定量檢測與組織化學染色結(jié)果表明長度為953 bp的調(diào)控序列啟