擬南芥β-葡糖苷酶19基因啟動(dòng)子的克隆及功能初析.pdf

1、在對(duì)作物進(jìn)行抗性改良、產(chǎn)量提高和品質(zhì)改進(jìn)時(shí)，需要將外源基因轉(zhuǎn)入到特定的作物體內(nèi)，這些外源基因需要在相應(yīng)的啟動(dòng)子序列調(diào)控下進(jìn)行表達(dá)。由于目前用于遺傳改良的植物啟動(dòng)子數(shù)量有限，本研究以擬南芥β-葡萄糖苷酶19（Beta-glucosidase，BGLU19）基因啟動(dòng)子為研究對(duì)象對(duì)其進(jìn)行活性分析，以期獲得適宜作物遺傳改良的啟動(dòng)子，滿足植物基因工程的需要。
　　本研究首先對(duì)AtBGLU19啟動(dòng)子的序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其中的組織特異性元件

2、和脅迫應(yīng)答元件。并通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物克隆AtBGLU19啟動(dòng)子，構(gòu)建植物表達(dá)載體，利用花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥并篩選獲得轉(zhuǎn)基因純合植株。最后通過(guò)GUS組織化學(xué)染色對(duì)其活性進(jìn)行了穩(wěn)定表達(dá)分析，并利用農(nóng)桿菌侵染煙草對(duì)其活性進(jìn)行了瞬時(shí)表達(dá)分析。研究結(jié)果表明AtBGLU19啟動(dòng)子是一個(gè)種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子，并且可以在異源植物中表達(dá)?？傊?，通過(guò)本研究為作物遺傳改良提供了一個(gè)可供選擇的種子高表達(dá)啟動(dòng)子，也為后續(xù)β-葡萄糖苷酶基因功能研究、基因工程改造植物

3、β-葡萄糖苷酶基因從而獲得生產(chǎn)用β-葡萄糖苷酶打下良好的基礎(chǔ)。本論文的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.利用生物信息學(xué)方法篩選獲得種子特異性表達(dá)基因。利用AtGenExpress Visualization Tool和Genevisible Expression Data等在線網(wǎng)站對(duì)TAIR網(wǎng)站擬南芥基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)AtBGLU19基因在種子中表達(dá)量非常高，是一個(gè)種子特異性表達(dá)基因，因此推測(cè)AtBGLU19啟動(dòng)子可能是種

4、子特異性表達(dá)啟動(dòng)子。
　　2.通過(guò)手動(dòng)檢索和在線軟件PLACE、PlantCARE對(duì)AtBGLU19啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，鑒定出很多與組織特異性表達(dá)和脅迫應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件。其中有作用明確且具相關(guān)性的三個(gè)種子特異性表達(dá)調(diào)控元件：GCN4元件（TGAGTCA）、AACA元件（AACAAAA）和ACGT元件（GTACGT）；以及響應(yīng)低溫、ABA和干旱脅迫的順式作用元件：四個(gè)ABA響應(yīng)元件ABRE（ACGTACA、CGTACGTGCA

5、和GACACGTGGC）、兩個(gè)與冷脅迫有關(guān)的as-1元件（TGACG）和ACGTCA元件、一個(gè)MBS干旱應(yīng)答元件（TAACTG）。
　　3.通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增AtBGLU19啟動(dòng)子序列。經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，獲得的目的條帶回收純化，通過(guò)酶切克隆至表達(dá)載體。酶切及測(cè)序結(jié)果表明成功構(gòu)建了pBGLU19-GUS植物表達(dá)載體。
　　4.通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法來(lái)獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，通過(guò)PCR擴(kuò)增和抗生素進(jìn)行篩選獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥純合

6、株系，對(duì)純系植株的種子、葉片、花、莢果等進(jìn)行GUS染色實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明AtBGLU19基因啟動(dòng)子在種子中的表達(dá)量最高，AtBGLU19啟動(dòng)子是種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子。
　　5.利用農(nóng)桿菌侵染法將植物表達(dá)載體pBGLU19-GUS注射到煙草葉片，用瞬時(shí)表達(dá)的方法驗(yàn)證AtBGLU19基因啟動(dòng)子異源表達(dá)情況。GUS組織化學(xué)染色結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入pBGLU19-GUS質(zhì)粒載體的煙草葉片被X-Gluc溶液染成藍(lán)色，而野生型煙草葉片無(wú)染色，表明AtB