擬南芥β-葡糖苷酶19基因啟動子的克隆及功能初析.pdf

1、在對作物進行抗性改良、產(chǎn)量提高和品質改進時，需要將外源基因轉入到特定的作物體內(nèi)，這些外源基因需要在相應的啟動子序列調控下進行表達。由于目前用于遺傳改良的植物啟動子數(shù)量有限，本研究以擬南芥β-葡萄糖苷酶19（Beta-glucosidase，BGLU19）基因啟動子為研究對象對其進行活性分析，以期獲得適宜作物遺傳改良的啟動子，滿足植物基因工程的需要。
　　本研究首先對AtBGLU19啟動子的序列結構進行分析，預測其中的組織特異性元件

2、和脅迫應答元件。并通過設計特異引物克隆AtBGLU19啟動子，構建植物表達載體，利用花序侵染法轉化擬南芥并篩選獲得轉基因純合植株。最后通過GUS組織化學染色對其活性進行了穩(wěn)定表達分析，并利用農(nóng)桿菌侵染煙草對其活性進行了瞬時表達分析。研究結果表明AtBGLU19啟動子是一個種子特異性表達啟動子，并且可以在異源植物中表達。總之，通過本研究為作物遺傳改良提供了一個可供選擇的種子高表達啟動子，也為后續(xù)β-葡萄糖苷酶基因功能研究、基因工程改造植物

3、β-葡萄糖苷酶基因從而獲得生產(chǎn)用β-葡萄糖苷酶打下良好的基礎。本論文的主要實驗結果如下：
　　1.利用生物信息學方法篩選獲得種子特異性表達基因。利用AtGenExpress Visualization Tool和Genevisible Expression Data等在線網(wǎng)站對TAIR網(wǎng)站擬南芥基因表達譜數(shù)據(jù)進行分析比較，發(fā)現(xiàn)AtBGLU19基因在種子中表達量非常高，是一個種子特異性表達基因，因此推測AtBGLU19啟動子可能是種

4、子特異性表達啟動子。
　　2.通過手動檢索和在線軟件PLACE、PlantCARE對AtBGLU19啟動子序列進行分析，鑒定出很多與組織特異性表達和脅迫應答相關的順式作用元件。其中有作用明確且具相關性的三個種子特異性表達調控元件：GCN4元件（TGAGTCA）、AACA元件（AACAAAA）和ACGT元件（GTACGT）；以及響應低溫、ABA和干旱脅迫的順式作用元件：四個ABA響應元件ABRE（ACGTACA、CGTACGTGCA

5、和GACACGTGGC）、兩個與冷脅迫有關的as-1元件（TGACG）和ACGTCA元件、一個MBS干旱應答元件（TAACTG）。
　　3.通過設計特異引物擴增AtBGLU19啟動子序列。經(jīng)過PCR擴增后，獲得的目的條帶回收純化，通過酶切克隆至表達載體。酶切及測序結果表明成功構建了pBGLU19-GUS植物表達載體。
　　4.通過農(nóng)桿菌介導的花序侵染法來獲得轉基因擬南芥植株，通過PCR擴增和抗生素進行篩選獲得轉基因擬南芥純合

6、株系，對純系植株的種子、葉片、花、莢果等進行GUS染色實驗，結果表明AtBGLU19基因啟動子在種子中的表達量最高，AtBGLU19啟動子是種子特異性表達啟動子。
　　5.利用農(nóng)桿菌侵染法將植物表達載體pBGLU19-GUS注射到煙草葉片，用瞬時表達的方法驗證AtBGLU19基因啟動子異源表達情況。GUS組織化學染色結果表明，轉入pBGLU19-GUS質粒載體的煙草葉片被X-Gluc溶液染成藍色，而野生型煙草葉片無染色，表明AtB